[發(fā)明專(zhuān)利]一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110324385.3
• 申請(qǐng)日: 2011-10-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102352378A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙鋼;王躍華;張紅玉;陳燕;湯有舉;孫雁霞;鄔曉勇;鄒亮;彭鐮心;胡一冰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 成都大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/84
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 成都科奧專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，特別是涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由于苦蕎其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì)，因而被譽(yù)為“降血糖、降血壓、降血脂”的三降食品。隨著其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的不斷發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥植物資源越來(lái)越受到人們的青睞。由于苦蕎麥植物自花授粉的特點(diǎn)使其在生產(chǎn)育種上人工雜交難以成功，因此目前苦蕎麥在育種方面仍未獲得重大突破。

目前借助發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究已成為近些年的研究熱點(diǎn)。發(fā)根農(nóng)桿菌中含有致使植物產(chǎn)生毛狀根的Ri質(zhì)粒，在Vir區(qū)基因產(chǎn)物的協(xié)助下，Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段能轉(zhuǎn)移進(jìn)植物核基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成功的植物產(chǎn)生大量的毛狀根。毛狀根具有生長(zhǎng)速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可藥用的次生代謝產(chǎn)物的特征。農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上攜帶的生根基因不僅能使被感染植物部位產(chǎn)生大量的毛狀根，而且由產(chǎn)生的毛狀根還可以獲得再生的轉(zhuǎn)化植株，這些植株可表現(xiàn)出許多穩(wěn)定遺傳的表現(xiàn)變異。

目前已有關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蕎麥植物遺傳轉(zhuǎn)化方面研究的報(bào)道，如黃萱的博士論文《小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦蕎遺傳轉(zhuǎn)化》和金紅的論文《關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌A4對(duì)蕎麥的遺傳轉(zhuǎn)化》。從這些報(bào)道可發(fā)現(xiàn)，目前在由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)蕎麥植物的遺傳轉(zhuǎn)化中所采用的外植體只有子葉、莖尖和下胚軸較幼嫩的植物器官。采用植物幼嫩器官作為外植體，雖然因細(xì)胞壁較薄，能促使農(nóng)桿菌的T-DNA更易進(jìn)入被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中而使其轉(zhuǎn)化成功；但另一方面，由于植物幼嫩器官的細(xì)胞分化程度較低，細(xì)胞中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物也較低，所以誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物的含量也較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法能產(chǎn)生含有大量次生代謝產(chǎn)物的毛狀根。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案由如下步驟構(gòu)成：

菌種的活化培養(yǎng)：將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2天后，用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)1～2天至菌液OD₆₀₀＝0.2～0.6，所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri1601，培養(yǎng)溫度為25～30℃；

無(wú)菌苗的獲得：將苦蕎種子的種皮剝?nèi)ィ扔?5％的酒精消毒30～60s，再用0.1％升汞消毒3～10min，然后用無(wú)菌水沖洗2～5次后，接種于不加激素的MS培養(yǎng)基上，在22～28℃、光照強(qiáng)度1000～2000lx，、每天光照8～12h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：選取葉齡在2～30天、生長(zhǎng)狀況良好的苦蕎麥無(wú)菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+2，4-D?0.5～4mg·L^-1+6-BA?0.1～1.5mg·L^-1+NAA?0～1mg·L^-1+乙磺酸0～1g·L^-1+蔗糖15～50g·L^-1中進(jìn)行0～4天的預(yù)培養(yǎng)，然后將其取出放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中浸染2～18min，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行0～4天的共培養(yǎng)，接著再轉(zhuǎn)入含有頭孢噻肟鈉200～500mg/L的脫菌水中浸洗2～6min，然后用無(wú)菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉300～600mg/L+瓊脂6～8g/L+蔗糖15～40g/L中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，直到產(chǎn)生大量毛狀根。

上述不加激素的MS培養(yǎng)基為MS+瓊脂6～8g/L+蔗糖15～50g/L。

本發(fā)明由于采用分化程度相對(duì)較高且黃酮類(lèi)物質(zhì)含量最高的苦蕎葉片作為外植體，因此大大提高了毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量，為苦蕎麥有效組分的快速生產(chǎn)提供了一種新的途徑。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)菌種的活化培養(yǎng)：將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri1601劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天后，用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)1天左右至菌液OD₆₀₀＝0.5；