[發(fā)明專利]一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110324385.3
• 申請(qǐng)日: 2011-10-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102352378A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙鋼;王躍華;張紅玉;陳燕;湯有舉;孫雁霞;鄔曉勇;鄒亮;彭鐮心;胡一冰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務(wù)所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

1.一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟：

菌種的活化培養(yǎng)：將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2天后，用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)1～2天至菌液OD₆₀₀＝0.2～0.6，所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri1601，培養(yǎng)溫度為25～30℃；

無(wú)菌苗的獲得：將苦蕎種子的種皮剝?nèi)ィ扔?5％的酒精消毒30～60s，再用0.1％升汞消毒3～10min，然后用無(wú)菌水沖洗2～5次后，接種于不加激素的MS培養(yǎng)基上，在22～28℃、光照強(qiáng)度1000～2000lx，、每天光照8～12h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：選取葉齡在2～30天、生長(zhǎng)狀況良好的苦蕎麥無(wú)菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+2，4-D?0.5～4mg·L^-1+6-BA?0.1～1.5mg·L^-1+NAA?0～1mg·L^-1+乙磺酸0～1g·L^-1+蔗糖15～50g·L^-1中進(jìn)行0～4天的預(yù)培養(yǎng)，然后將其取出放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中浸染2～18min，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行0～4天的共培養(yǎng)，接著再轉(zhuǎn)入含有頭孢噻肟鈉200～500mg/L的脫菌水中浸洗2～6min，然后用無(wú)菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉300～600mg/L+瓊脂6～8g/L+蔗糖15～40g/L中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，直到產(chǎn)生大量毛狀根。