[發明專利]煙草普通花葉病毒抗性的種內基因改良方法

無效

• 申請號: 201110323873.2
• 申請日: 2011-10-24
• 公開（公告）號: CN102690839A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 趙杰宏;王軼;韓潔;趙丹
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說是涉及一種利用普通煙草種內的基因表達調控序列和功能基因對普通煙草種質進行改良的方法。?

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背景技術

轉基因技術打破了物種界限，使不同物種間的基因可以進行前所未有的新組合，但是在轉基因作物育種中，往往既引入了其他物種的功能基因、啟動子、終止子等表達調控序列，也轉入了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因、綠色熒光蛋白（GFP）基因、抗生素或除草劑抗性基因等選擇標記。這些轉基因作物在展現優異特性的同時，也給社會大眾帶來環境安全和食品安全等多方面憂慮，尤其是轉基因植物用來生產功能食品、藥品和工業原料，人們擔心這些分子及其產物可能會污染環境和人類的食物鏈。?

這些顧慮延滯了轉基因作物的生產和應用，因此轉基因安全研究也成為新的科學熱點領域，國際上就轉基因的安全性方面也進行了許多研究和探索，新一代植物轉基因技術不斷涌現，如采用全植物源啟動子和基因進行轉化植物，而不采用微生物或動物來源DNA的轉化法（All-native?DNA?transformation）、用一系列分子策略阻止轉基因運動的基因利用限制技術（Genetic?use?restriction?technology，GURT）、無標記共轉化技術（Marker?free?co-transformation）、轉化基因表達功能后誘導刪除技術（gene-deletor）等。?

這些研究主要通過各種技術手段對轉入作物的外源DNA序列的遷移，實現絕大部分的限制或刪除，但依然難以消除轉基因作物給食品安全和環境安全帶來的顧慮，而種內基因轉移是容易被公眾接受的，有助于消除以上一些安全方面的顧慮。如果將種內基因轉移與無標記基因轉化相結合，獲得的改良作物將非常接近傳統雜交育種的產物，但這種策略在煙草上的研究和應用還沒有報道。?

煙草普通花葉病毒（Tobacco?mosaic?virus,?TMV）是目前世界上研究較為深入的模式病毒，是單鏈RNA（ssRNA）病毒。TMV具有寄主范圍廣、抗逆性強、生產危害大等特點，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和莧科等多種植物，在全世界主要煙草產區均有分布，使煙草和其他農作物的產量和品質大大降低。據報道全世界每年僅TMV?造成的危害就超過1?億美元。抗TMV煙草種質的培育主要通過傳統雜交育種，但很難有效打破抗性基因與不利性狀基因的連鎖，再加上雜交育種周期長，導致優質可用的種質材料較難培育，因此采用煙草TMV抗性的種內基因轉化與無標記基因選擇相結合，以改良煙草將具有廣闊的應用潛力。?

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發明內容

本發明目的是克服上述缺點而提供的一種對煙草進行基因工程改良中，同時避免非煙草源基因污染和標記基因引起的環境風險，實現轉基因安全的煙草普通花葉病毒抗性的種內基因改良方法。?

????本發明的一種煙草普通花葉病毒（TMV）抗性的種內基因改良方法，包括以下步驟：?

（1）克隆煙草Ubi.u4基因的組成型表達啟動子Pubi.u4：

煙草組成型表達啟動子Pubi.u4是根據基因銀行登記號(Genbank?Accession)：X77456中提供的Pubi.u4啟動子序列特點，設計和合成擴增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位點，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位點。用PCR方法克隆煙草Ubi.u4?基因796?bp的?Pubi.u4啟動子。

Pubi.u4啟動子的擴增引物為：?

Ubi?-1：5’-?CCC?AAG?CTT?GGA?GGC?TAA?CTA?CGT?TAG?AGC-3’；?

Ubi-?2：5’-TGC?TCT?AGA?TCT?GTA?TAT?ACA?GAA?AAG?GTT-3’；?

????（2）人工合成終止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:?

煙草終止子Tubi.u4序列為基因銀行登記號(Genbank?Accession)：X77456中提供的終止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位點（HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI）序列和基因銀行登記號(Genbank?Accession):?HM036220登錄的左右邊界序列組成；