[發(fā)明專利]煙草普通花葉病毒抗性的種內(nèi)基因改良方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110323873.2
• 申請(qǐng)日: 2011-10-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102690839A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙杰宏;王軼;韓潔;趙丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州省煙草科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 貴陽(yáng)東圣專利商標(biāo)事務(wù)有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

1.?一種煙草普通花葉病毒抗性的種內(nèi)基因改良方法，包括以下步驟：

（1）克隆煙草Ubi.u4基因的組成型表達(dá)啟動(dòng)子Pubi.u4：

煙草組成型表達(dá)啟動(dòng)子Pubi.u4是根據(jù)基因銀行登記號(hào)(Genbank?Accession)：X77456中提供的Pubi.u4啟動(dòng)子序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成擴(kuò)增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位點(diǎn)，用PCR方法克隆煙草Ubi.u4?基因796?bp的?Pubi.u4啟動(dòng)子；

Pubi.u4啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物為：?

Ubi?-1：5’-?CCC?AAG?CTT?GGA?GGC?TAA?CTA?CGT?TAG?AGC-3’；?

Ubi-?2：5’-TGC?TCT?AGA?TCT?GTA?TAT?ACA?GAA?AAG?GTT-3’；?

????（2）人工合成終止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:?

煙草終止子Tubi.u4序列為基因銀行登記號(hào)：X77456中提供的終止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位點(diǎn)HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI序列和基因銀行登記號(hào):?HM036220登錄的左右邊界序列組成；

常規(guī)方法合成兩端添加BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的Tubi.u4序列，以及合成兩端添加BglII酶切位點(diǎn)的LB-MCS-RB序列備用;

（3）克隆煙草功能基因TMV-N：

根據(jù)基因銀行登記號(hào):?EF091690登錄的煙草TMV-N基因的完整序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成擴(kuò)增引物，上游引物N-1引入KpnI酶切位點(diǎn)，下游引物N-2引入SmaI酶切位點(diǎn)，用反轉(zhuǎn)錄PCR方法從普通煙草RNA中克隆3426?bp的煙草普通花葉病毒抗性基因TMV-N；

TMV-N基因的擴(kuò)增引物為：

N-1：5’-CGG?GGT?ACC?ATG?GCA?TCT?TCT?TCT?TCT?TC-3’；

N-2：5’-TCC?CCC?GGG?TCA?CCC?ATT?GAT?GAG?CTC?AT-3’；

（4）構(gòu)建煙草種內(nèi)基因表達(dá)載體：

將克隆的Pubi.u4啟動(dòng)子、TMV-N基因序列和人工合成的Tubi.u4終止子、LB-MCS-RB序列分別連接到常規(guī)載體pGEM-T?easy上，構(gòu)建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆，測(cè)序，以獲得正確的Pubi.u4啟動(dòng)子、TMV-N基因、Tubi.u4終止子和LB-MCS-RB序列；

用BglII單酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段構(gòu)建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI雙酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4小片段構(gòu)建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI雙酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段構(gòu)建到pSH-P，從而獲得煙草種內(nèi)基因表達(dá)母載體pSH-P-T；

用KpnI和SmaI雙酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N小片段構(gòu)建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，從而得到由煙草組成型啟動(dòng)子Pubi.u4驅(qū)動(dòng)煙草TMV抗性基因TMV-N表達(dá)，由煙草終止子Tubi.u4終止基因表達(dá)的煙草TMV-N種內(nèi)基因表達(dá)載體pSH-P-N-T；

（5）共轉(zhuǎn)化煙草外植體

將種內(nèi)基因表達(dá)載體pSH-P-N-T與含β-葡萄糖苷酸酶基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體pSH737分別用凍融法轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌LBA4404，分別挑取含有表達(dá)載體pSH-P-N-T或表達(dá)載體pSH737的農(nóng)桿菌單菌落，在含100mg·L^-1?卡那霉素和20?mg·L^-1?利福平的常規(guī)YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5~0.7，6000rpm離心5min收集菌體，用重懸培養(yǎng)基重懸菌體后，按照1:1的體積比混合兩載體的重懸液；挑選鮮嫩的煙草外植體于混合的重懸菌液中浸泡10min，用無(wú)菌濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)入含頭孢霉素?300mg·L^-1的脫菌培養(yǎng)基上，保持選擇壓繼代2次，直至脫菌完全；將脫菌完全的外植體接于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為3000~4000lux，12~14h/d；每15~20天繼代一次，當(dāng)分化的幼苗長(zhǎng)至3~5cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)至5~10cm時(shí)打開(kāi)瓶蓋，煉苗3~5d后移植到土壤中；

（6）子代分離篩選

移栽成活的T₀代抗性轉(zhuǎn)化苗切取葉片組織對(duì)β-葡萄糖苷酸酶進(jìn)行染色檢測(cè)，對(duì)染色呈藍(lán)色的陽(yáng)性煙株提取DNA，對(duì)嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的497?bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙株套袋留種，然后種植T₁代，并對(duì)T₁代繼續(xù)進(jìn)行GUS染色和PCR檢測(cè)，最后從子代中篩選出GUS染色為陰性，但嵌合序列PCR陽(yáng)性的煙株，從而獲得無(wú)標(biāo)記基因的煙草TMV抗性種內(nèi)基因改良植株；

嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的PCR檢測(cè)引物：

????Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；

Test?-2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’。