[發明專利]一種分離人精原干細胞的方法

有效

• 申請號: 201110321182.9
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN102344909A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 何祖平;劉陽;劉建芳;張楨珍;李錚;楊施;郭成志;馬猛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司 31128
• 代理人: 嚴新德

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種干細胞的分離方法，具體來說是一種分離人精原干細胞的方法。

背景技術

干細胞是指原始的未分化的細胞，既能自我更新，又能分化為有功能的子代細胞。目前干細胞研究已經成為迄今國內外生命科學研究的前沿，對治療人類疾病中的細胞移植、組織工程和基因治療都具有重大意義。精原干細胞(spermatogonial?stem?cells，SSCs)是指A型精原細胞的一種亞型細胞。精原干細胞是雄性動物和人類將遺傳物質傳遞至后代唯一的成體干細胞。精原干細胞也是雄性動物和人類生精過程中的基礎，哺乳動物的生精過程在曲細精管內完成，并包含精原干細胞自我更新和分化為成熟精子的復雜過程。經過近幾年的研究，動物精原干細胞的的相關研究已經有了很大的突破和發現。相關研究證實GFRA1(GDNF?family?receptor?alpha?1)是小鼠精原干細胞和祖細胞的細胞表面分子標志。最近，研究發現GPR125(G?protein-coupled?receptor，GPR125)也是小鼠精原干細胞及其祖細胞的細胞表面分子標志。現在國內外關于精原干細胞的研究正在逐漸從動物向人類轉變，也為人類疾病的治療提供新的研究方向。

隨著環境與生活方式改變、生育年齡推遲、癌癥治療等諸多因素影響，人們生育能力明顯下降。據世界衛生組織(WHO)統計，不孕不育疾病將會成為繼癌癥、心血管疾病之后的第三大嚴重影響人類健康的疾病。2009年，中國人口協會公布的《中國不孕不育現狀調研報告》顯示：我國不孕不育率已高達15％-20％，其中由男性原因引起的不孕約占50％，男性不育已經成為影響我國生殖健康的重大疾病。精原干細胞的分離和純化將為治療男性不育方面提供了廣闊的臨床應用前景，解決非梗阻性無精子癥患者自身生育后代的醫學難題，以及為放療、化療導致不育的男性癌癥患者提供了男性生育保障。

近年來，研究發現精原干細胞體外培養可獲得全能性(Pluripotency)成為類胚胎干細胞(ES-like?cells)。小鼠精原干細胞能產生心肌細胞、內皮細胞、血液細胞和胰島細胞。人類精原干細胞能生成肌細胞、成骨細胞、神經細胞和胰島細胞，這將為再生醫學和人類疾病的細胞治療提供新的途徑。現在關于小鼠精原干細胞的分離方法主要是酶消化法結合密度梯度離心，這種方法多得到的精原干細胞純度有限。人精原干細胞的分離剛剛開始。如何能夠獲得大量的、高純度的人精原干細胞，已經成為精原干細胞在基礎研究與今后臨床應用的主要問題。為了得到高純度的人類精原干細胞，本發明將應用人精原干細胞表面所具有的特異性的標記物通過免疫細胞學原理將精原干細胞與其他種類生殖細胞分離，從而獲得高純度的精原干細胞以滿足其基礎研究和臨床應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種分離人精原干細胞的方法，所述的這種分離人精原干細胞的方法要解決現有技術人類精原干細胞分離的方法中存在的分離細胞少、純度不高的技術問題。

本發明一種分離人精原干細胞的方法，包括機械分離睪丸組織的步驟，將睪丸組織加工成半液態，然后在半液態的睪丸組織中加入消化酶液I，將睪丸組織消化成單個的曲細精管，還包括在曲細精管中加入消化酶液II的步驟，將曲細精管消化為單個細胞，還包括將單個細胞中的生殖細胞和支持細胞分離的步驟，還包括采用免疫磁珠細胞分選術分離GPR125陽性精原干細胞和GFRA1陽性精原干細胞的步驟，還包括采用免疫細胞化學法鑒定分離的GPR125陽性精原干細胞和GFRA1陽性精原干細胞的步驟。

機械分離睪丸組織的步驟包括：

1)稱取1～2克睪丸組織置于8～12ml?DMEM/F12中，剪成體積(1～2)×(1～2)×(1～2)mm³組織小塊，用DMEM/F12清洗2～5次，除去殘留的血細胞；

2)用眼科剪刀將睪丸組織剪至半液態，另外添加15～40ml?DMEM/F12，然后將組織轉移到玻璃容器內；

3)向步驟2)的睪丸組織中加入消化酶液I，置于34℃水浴搖床中，孵育10～15min。

4)鏡檢，確保所有睪丸組織塊均已消化成單個曲細精管，將含有曲細精管的消化液轉移至另一新的離心管中，加入新鮮的DMEM/F12終止消化。

在曲細精管中加入消化液酶II的步驟包括：

1)將含有曲細精管的消化液靜置，用移液管移除上清液，加入新鮮DMEM/F12清洗曲細精管。重復操作2～5次，除去所有的肌樣細胞(Myoid?cells)和萊氏細胞(Leydig?cells)；