[發明專利]一種分離人精原干細胞的方法

有效

• 申請號: 201110321182.9
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN102344909A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 何祖平;劉陽;劉建芳;張楨珍;李錚;楊施;郭成志;馬猛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司 31128
• 代理人: 嚴新德

1.一種分離人精原干細胞的方法，其特征在于：包括一個機械分離睪丸組織的步驟，在該步驟中，將睪丸組織加工成半液態，然后在半液態的睪丸組織中加入消化酶液I，將睪丸組織消化成單個的曲細精管，還包括一個在曲細精管中加入消化酶液II的步驟，在該步驟中，將曲細精管消化為單個細胞，還包括一個將單個細胞中的生殖細胞和支持細胞分離的步驟、一個采用免疫磁珠細胞分選術分離GPR125陽性精原干細胞和GFRA1陽性精原干細胞步驟和一個采用免疫細胞化學法鑒定分離的GPR125陽性精原干細胞和GFRA1陽性精原干細胞的步驟。

2.如權利要求1所述的分離人精原干細胞的方法，其特征在于：所述的機械分離睪丸組織的步驟包括：

1)稱取1～2克睪丸組織置于8～12ml?DMEM/F12中，剪成體積(1～2)×(1～2)×(1～2)mm³組織小塊，用DMEM/F12清洗2～5次，除去殘留的血細胞；

2)用眼科剪刀將睪丸組織剪至半液態，另外添加15～40ml?DMEM/F12，然后將組織轉移到玻璃容器內；

3)向步驟2)的睪丸組織中加入消化酶液I，置于34℃水浴搖床中，孵育10～15min。

4)鏡檢，確保所有睪丸組織塊均已消化成單個曲細精管，將含有曲細精管的消化液轉移至另一新的離心管中，加入新鮮的DMEM/F12終止消化。

3.如權利要求1所述的分離人精原干細胞的方法，其特征在于：所述的在曲細精管中加入消化液酶II的步驟包括：

1)將含有曲細精管的消化液靜置，用移液管移除上清液，加入新鮮DMEM/F12清洗曲細精管，重復操作2～5次，除去所有的肌樣細胞和萊氏細胞；

2)向步驟1)得到的曲細精管中加入消化酶液II；

3)將步驟2)中的混合液用玻璃移液管轉移至另一新的玻璃容器中，置于34℃水浴搖床，孵育8-15min；

4)消化后，用玻璃移液管輕輕吹打10～15次，鏡檢；如還有曲細精管，再于34℃水浴搖床孵育8-15min，確保曲細精管全部消化為單個細胞。

4.如權利要求1所述的分離人精原干細胞的方法，其特征在于：所述的將單個細胞中的男性生殖細胞和支持細胞分離的步驟包括：

1)在消化液中加入新鮮DMEM/F12終止消化，靜止，收集上清液離心；

2)離心后，棄上清液，加入50ml?DMEM/F12重懸細胞，靜止8-12min，收集上清液離心；

3)離心后，棄上清液，加入適量新鮮DMEM/F12重懸細胞，用30-45μm尼龍網過濾，除去細胞團；

4)將步驟3)得到的細胞懸液離心，棄上清液，然后加入新鮮8-12ml含10％的胎牛血清的DMEM/F12；

5)將步驟4)中得到的細胞懸液在0.05～0.2％明膠預處理的培養瓶培養后，分離男性生殖細胞和支持細胞。

5.如權利要求1所述的分離人精原干細胞的方法，其特征在于：在步驟5)中，將細胞懸液接種于培養瓶中，34℃培養1～5小時，支持細胞首先貼于瓶底，而生殖細胞仍懸浮于培養基中，收集培養基后500～1500r/min離心，棄上清液，收集男性生殖細胞。

6.如權利要求1所述的分離人精原干細胞的方法，其特征在于：所述的采用免疫磁珠細胞分選術分離GPR125陽性精原干細胞和GFRA1陽性精原干細胞的步驟包括：

1)將生殖細胞重懸于DMEM培養液，在細胞懸液中加入GPR125抗體或GFRA1抗體，1～7℃旋轉培養過夜；

2)孵育后，用0.4％臺盼藍法檢測細胞活率，然后用BSA-EDTA-PBS緩沖液將細胞洗滌，離心后將細胞重懸于80～100μl的BSA-EDTA-PBS緩沖液中；

3)將20～30μl免疫磁珠加入細胞懸液，1～7℃旋轉培養，時間不超過20min，補加400μl?BSA-EDTA-PBS緩沖液，終體積為500μl；

4)取5μl細胞懸液用0.4％臺盼藍法檢測細胞活率；

5)將步驟3)得到的細胞懸液經免疫磁珠柱預分離器過濾后，轉入BSA-EDTA-PBS緩沖液平衡的分離柱中，同時將分離柱置于磁場中；

6)用BSA-EDTA-PBS緩沖液沖洗分離柱，收集未被標記的細胞GPR125或GFRA1陰性細胞；

7)將分離柱脫離磁場，添加BSA-EDTA-PBS緩沖液，收集GPR125陽性精原干細胞或GFRA1陽性精原干細胞。