[發(fā)明專利]一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110320911.9
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN102321664A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 封磊;宋萍;洪偉;吳承禎;陳敏捷
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤（Tripterygium?wilfordii?Hok?.?f1）毛狀根的方法，并初步建立了雷公藤毛狀根離體培養(yǎng)體系。

背景技術(shù)

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeterium?rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobactefium)一類革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌，可以侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物?，通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，將其所含的Ri?質(zhì)粒上的一段DNA?（T-DNA）轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。

雷公藤是一種雙子葉木質(zhì)藤本植物，分布于南方福建、江西、浙江、廣東、湖南、湖北、臺灣等省份。是珍貴的藥用植物。雷公藤提取物中含有70種以上的有效成分，主要有；生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類等次生代謝物。這些成分具有解毒散結(jié)、活血化瘀、消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)整、抗生育等多種藥理作用。廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺病、腎病、皮膚病、白血病等疾病。

由于植物次生代謝物質(zhì)具有極其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，至今仍沒有找到有效的或經(jīng)濟(jì)可行合成方法。雖然近幾十年來利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究獲得了迅速發(fā)展，但是由于植物細(xì)胞培養(yǎng)是采用未分化的細(xì)胞，其生長與代謝通路常常不相容的，因而次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力低且不穩(wěn)定，從而限制了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。而經(jīng)過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所形成的毛狀根（hair?root）由于其生長迅速且遺傳性狀穩(wěn)定，成為藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的重要原料。毛狀根本質(zhì)是一種惡性增殖的器官、相對于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，其具有激素自養(yǎng)、生長迅速、周期短等特點(diǎn)，因而可進(jìn)行大量培養(yǎng)。同時(shí)它起源于單細(xì)胞，遺傳性狀穩(wěn)定，擁有親本植株的特征次生代謝途徑。

利用藥用植物毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究已有幾十年的歷史。如Mano等（1986）建立了29個(gè)日本莨菪（Scoplia?japinlica）毛狀根無性系，研究表明均能產(chǎn)生阿托品烷生物堿，從中選育出的克隆，其重量的增加比正常植株高出102倍，莨菪堿含量高達(dá)1.3%，為原植株根中的3倍；Yshikawa和Furuya（1987）通過人參的愈傷組織成功誘導(dǎo)出了毛狀根，這種毛狀根在無外源激素的條件下生長迅速，是用激素誘導(dǎo)人參根快速增長的2倍，毛狀根中有效成分人參皂甙的含量最高可達(dá)干重的0.95%，高于在生根和天然栽培根的含量，Parr等（1988）通過誘導(dǎo)長春花形成的毛狀根，并從中檢測到了具有抗癌作用的長春堿，但通過長春花的細(xì)胞培養(yǎng)卻無法得到這種生物堿，說明毛狀根能夠合成某些懸浮細(xì)胞不能合成的次生代謝物質(zhì)。??

目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)利用雷公藤毛狀根對其活性物質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，利用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素，可用以填補(bǔ)中藥缺口。

本發(fā)明的方法包括（1）無菌外植體的獲得；（2）發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備；（3）農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)毛狀根；（4）毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，所述毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，是在27±1℃暗培養(yǎng)條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1∕2MS固體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1∕2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)保存。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備如下：發(fā)根農(nóng)桿菌活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基中，27±1℃黑暗條件下120-180r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5-0.8，收集菌液，并將菌體在4℃條件下，8000r/min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌1∕2MS液體培養(yǎng)基中。

農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)毛狀根的方法為：將無菌外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共同培養(yǎng)于1∕2MS液體培養(yǎng)基內(nèi)，加入識別信號因子乙酰丁香酮至150μmol/L，以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化，在120r/min，?27±1℃下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在27±1℃暗培養(yǎng)條件下，置于1∕2MS固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生。

對產(chǎn)生的無菌雷公藤毛狀根進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有相當(dāng)數(shù)量的雷公藤甲素（15.6559mg/g），明顯高于傳統(tǒng)雷公藤野生根及組培根中甲素的含量，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根。

圖2為雷公藤標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜檢測圖。

圖3為誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中雷公藤甲素含量的液相色譜檢測圖。

具體實(shí)施方式