[發明專利]用于樣品結構顯微成像的方法和設備

有效

• 申請號: 201110317596.4
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN102539395A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: J·佛林
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 王勇

技術領域

本發明涉及根據權利要求1或10前序部分的用于樣品結構顯微成像的方法和設備。

背景技術

近些年開發有一些光學顯微成像方法，用這些方法可基于一些單個標記、特別是熒光分子的連續、隨機的定位顯示出樣品結構，這些樣品結構小于傳統的光學顯微鏡的衍射條件下的分辨率極限。這樣的方法例如被描述在WO?2006/127692?A2；DE?10?2006?021?317?B3；WO?2007/128434?A1，US?2009/0134342?A1；DE?10?2008?024?568?A1；“Sub-diffraction-limit?imaging?by?stochastic?optical?reconstruction?microscopy(STORM)”Nature?Methods?3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution?of?Lambda/10?in?fluorescence?microscopy?using?fast?single?molecule?photo-switching”，Geisler?C.et?al，Appl.Phys.A，88，223-226(2007)中。該新的顯微技術分支也被稱為定位顯微技術。所應用的方法例如在文獻中以符號(F)PALM((熒光)光敏化定位顯微)，PALMIRA(具有獨立執行獲取的PALM)，GSD(IM)(基態損耗單分子返回)顯微)或者(F)STORM((熒光)隨機光學重構顯微)公開。

新的方法通常是用一些標記預先準備待成像的樣品結構，這些標記具有兩個可區別的狀態，也就是“亮”狀態和“暗”狀態。如果例如使用熒光著色劑作為標記，則亮狀態是能發熒光的狀態及暗狀態是不能發熒光的狀態。為了用高于傳統成像光學系統的分辨率極限的分辨率成像樣品結構，將標記的一小部分重復地轉化為亮狀態。該部分在下面被稱為活性部分。在此，形成該“活性”部分的標記的密度被這樣選擇，使得在亮狀態及由此在可光學顯微成像的狀態中的相鄰標記的平均間距大于成像光學系統的分辨率極限。形成活性部分的標記被成像在傳感器元件的空間分辨裝置上，使得由每個標記檢測到一個光斑形式的光分布，光斑的大小由透鏡系統的分辨率極限確定。

如果包含在活性部分中的標記的密度這樣地小，使得如前所述的標記的平均間距超過了由光學顯微成像裝置的分辨率極限預先確定的最小間距，則是處在所希望的活化狀態。該活化狀態保證了，由傳感器元件裝置檢測到的光斑的每一個精確地出自一個活化的標記。

之前所述的方法被在圖1中形象地說明。在圖1的左側部分中示出了一個原始數據-單幅圖像的序列，所述單幅圖像被用1，...，N逐一編號。示出在這些原始數據-單幅圖像中的光斑分別來自一個活化的標記部分，所述部分處在所希望的活化狀態中，也就是說，它的標記密度這樣得小，使得確保了這些標記的平均間距大于由光學顯微成像裝置的分辨率極限預先確定的最小間距。

在圖1的右上部分中示出了一個整體圖，該整體圖由原始數據-單幅圖像1，...，N疊加而成。該整體圖具有一個模糊的、在空間上未被分辨的光分布，該光分布在細節上沒有描述出待成像的樣品結構。

在圖1的左下部分中示出了一個整體圖，該整體圖由光分布的由原始數據-單幅圖像確定出的質心疊加而成。該整體圖具有明顯更高的分辨率，使得可良好地在細節上-在本例中以其三個同心的圓環-識別該樣品結構。

為了量化在上述方法中可達到的定位精度，參閱圖2，示出在圖1中的事實情況被再次純示意性地在圖2中說明。在圖2上部中示出了一個原始數據-單幅圖像的序列。待成像的、由一些同心圓環組成的樣品結構被在圖2中以虛線畫出并用參考標號2標記。

活性部分的各個標記產生光分布4，這些光分布的大小由成像光學裝置的分辨率能力給出并且在圖2中用Δx_Abb標識出。如在圖2中示意性示出地，所述標記彼此具有小于所述大小Δx_Abb的平均間距，使得這些光分布4不疊加。

在圖2下部中示出了光分布6，這些光分布通過質心確定由光分布4得出。可實現的定位精度由光分布6的大小Δx_SP給出。對于定位精度Δx_SP適用于：