[發明專利]一種通過還原途徑積累延胡索酸的釀酒酵母基因工程菌的構建及檸檬酸對其發酵特性的影響

無效

• 申請號: 201110317359.8
• 申請日: 2011-10-19
• 公開（公告）號: CN102363752A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 劉立明;徐國強;林新跑
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/63;C12P7/46;C12R1/865
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技術領域

本發明涉及一種通過還原途徑積累延胡索酸的釀酒酵母工程菌的構建方法及檸檬酸的添 加對其發酵特性的影響，屬于遺傳工程領域和發酵工程領域。

背景技術

作為一類重要的有機酸和最簡單的不飽和二羧酸，延胡索酸廣泛應用于食品、醫藥、化 工以及畜牧等行業中，特別是作為聚合反應和酯化反應的良好材料，延胡索酸被稱為最引人 矚目的十二大化工結構元件之一，因此，具有十分廣闊的市場和應用前景。石油化工路線 (petrochemical?routes)是當前延胡索酸的主要生產方法，該工藝因原料有限、環境污染嚴重、 生產成本高昂等問題，其產能的進一步擴大受到了限制。利用微生物發酵法生產延胡索酸引 起了廣泛的興趣，目前研究得最多的微生物是米根霉(Rhizopus?oryzae)和少根根霉(Rhizopus? arrhizus)。但是，R.oryzae和R.arrhizus表現出復雜的生長形態，發酵工藝難以控制，且其 遺傳信息和生化機制研究較少，代謝工程改造十分困難。釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae) 作為一種真核模式微生物，因具有：遺傳信息豐富，代謝改造操作方便；營養需求簡單，生 化分離工藝成本低廉；在低pH條件(甚至pH＜3.0)下生長良好；能耐受高濃度的底物；被 FDA認證為GRAS(Generally?Regarded?As?Safe)微生物，發酵產品具有安全性等優點而成為 發酵生產延胡索酸的潛在最適微生物。

釀酒酵母本身不具備積累延胡索酸的代謝途徑，但研究發現：R.oryzae是通過胞質還原 途徑積累大量延胡索酸的，并且，通過該途徑積累延胡索酸具有最大的理論得率(2mol/mol? glucose)，還可以通過丙酮酸羧化反應固定二氧化碳。那么，釀酒酵母是否也可以通過胞質還 原途徑大量積累延胡索酸并固定二氧化碳，是一個十分令人感興趣的問題。此外，當胞質還 原途徑引入釀酒酵母細胞后，是否導致氧化還原的不平衡及能量的供應不足，也是一個需要 考慮的問題，有報道認為，添加促進NADH合成的底物，如檸檬酸，可以提高胞內ATP的 水平，同時還可以誘導與能量代謝相關的關鍵酶和酶系的表達，促進胞內ATP的合成。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是通過在釀酒酵母里構建一條胞質還原TCA途徑，使得延胡 索酸得以積累，并通過添加檸檬酸來解決能量不足和氧化還原的問題。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：

通過在釀酒酵母中過量表達源于Rhizopus?oryzae?NRRL1526的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH和源于自身的丙酮酸羧化酶基因PYC2。并通過添加檸檬酸來解決能量不足和氧化還 原不平衡的問題。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種利用所述工程菌FMME-001-5發酵生產延 胡索酸的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：

1)提取米根霉(Rhizopus?oryzae?NRRL1526)的總RNA，經反轉錄后獲得其cDNA，然 后以cDNA為模板，PCR擴增獲得RoMDH。

2)提取釀酒酵母(S.cerevisiae?BMA64)的基因組，以其為模板，PCR擴增獲得PYC2。

3)重組質粒的構建：將基因RoMDH連接到質粒pY26TEF/GPD，獲得重組質粒 pY26TEF/GPD-RoMDH；將基因PYC2連接到質粒PRS305TEF1，獲得重組質粒 pRS305TEF1-PYC2。

4)重組質粒的轉化：將上述重組質粒先后轉化到處于感受態的釀酒酵母(S.cerevisiae? BMA64)細胞，通過篩選平板獲得陽性轉化子。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種利用所述工程菌發酵生產延胡索酸的方法。 將30℃、200rpm下培養12h的基因工程菌種子以5％的接種量轉入發酵培養基于30℃、200 rpm條件下培養78h，因FMME-001↑PYC2+↑RoMDH為缺陷型菌株，培養基需添加不同濃 度的Trp、Ade、His。

延胡索酸的測定方法：