[發明專利]一種通過還原途徑積累延胡索酸的釀酒酵母基因工程菌的構建及檸檬酸對其發酵特性的影響

無效

• 申請號: 201110317359.8
• 申請日: 2011-10-19
• 公開（公告）號: CN102363752A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 劉立明;徐國強;林新跑
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/63;C12P7/46;C12R1/865
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1.一種通過還原途徑積累延胡索酸的釀酒酵母工程菌，其特征在于該基因工程菌可 以通過胞質還原途徑積累延胡索酸。并且，檸檬酸的添加可以極大地促進延胡索酸的積累。

2.權利1所述的基因工程菌，其特征在于通過在釀酒酵母中表達源于米根霉(Rhizopus? oryzae?NRRL1526)的蘋果酸脫氫酶RoMDH和自身的PYC2，導致延胡索酸的積累。

3.權利要求1所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步：基因的獲得

提取米根霉(Rhizopus?oryzae?NRRL1526)的總RNA，經反轉錄后獲得其cDNA，然后 以cDNA為模板，PCR擴增獲得RoMDH；提取釀酒酵母(S.cerevisiae?BMA64)的基因組， 以其為模板，PCR擴增獲得PYC2；

第二步：基因的轉化及轉化子的驗證

將上述重組質粒轉化釀酒酵母感受態細胞，用相應的篩選平板獲得轉化子。后經提取重 組質粒，酶切驗證確認為陽性轉化子。

4.根據權利要求1所述的發酵特性研究，其特性是：將30℃、200rpm下培養12h的 基因工程菌種子以5％的接種量轉入發酵培養基于30℃、200rpm條件下培養78h，基因工程 菌可積累延胡索酸，其濃度可達到11.75±0.35mg/L，在添加檸檬酸的條件下可積累延胡索酸 為55.05±2.33mg/L。