[發(fā)明專(zhuān)利]一種用金磁微粒純化植物組織基因組DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110315771.6
• 申請(qǐng)日: 2011-10-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102344921A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔亞麗;魏旭旭;晁旭;張景閣;趙穩(wěn)操;李譚杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西安金磁納米生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 西安智邦專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 徐平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用金磁微粒純化多種類(lèi)型植物及不同部位的植物組織基因組DNA的方法。

背景技術(shù)

利用帶有目的基因的供體植物DNA直接轉(zhuǎn)化受體，篩選目的性狀變異后代，是植物基因工程與分子生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的實(shí)際應(yīng)用。從不同種屬的植物及其不同部位提取出質(zhì)量較高的基因組DNA進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)等下游實(shí)驗(yàn)是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，建立的方法對(duì)提取得到的基因組DNA的純度及濃度有較高要求。目前，植物組織基因組DNA提取方法都有很強(qiáng)的針對(duì)性，而且大都只能從新鮮的植物葉片中提取，這樣以來(lái)會(huì)對(duì)下游應(yīng)用帶來(lái)很大的局限性。

核酸純化方法大體上可分為兩種，一種是酚氯仿抽提液相純化法，一種是固相純化法。酚氯仿抽提法主要通過(guò)有機(jī)相-水相分配來(lái)除去雜質(zhì)達(dá)到純化核酸的目的。固相純化法則通過(guò)核酸與固相介質(zhì)的非特異可逆性結(jié)合，從而達(dá)到純化核酸的目的，其結(jié)合方式主要包括吸附結(jié)合和離子交換結(jié)合。

傳統(tǒng)的幾種植物基因組DNA提取方法存在一些缺點(diǎn)。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反復(fù)抽提與離心，耗費(fèi)大量的時(shí)間，人力、物力。此外，現(xiàn)有的植物基因組DNA純化的文獻(xiàn)報(bào)道基本上都是針對(duì)某種植物的新鮮葉片，如針對(duì)煙草的葉片、番茄葉片等開(kāi)發(fā)的有針對(duì)性的方法。因?yàn)椴煌参锏慕M織或同一植物的不同組織材料，由于其化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等差異，在提取基因組DNA時(shí)需選擇不同的方法或作一些特殊的處理，這為實(shí)驗(yàn)帶來(lái)極大的不便。因此，研究通用、快速適于植物不同部位組織基因組DNA的方法也非常重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用磁性納米復(fù)合材料進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速純化植物組織基因組DNA的方法，以解決背景技術(shù)操作復(fù)雜、純化率低、不具有通用性等問(wèn)題；可適用于純化不同植物的組織及同一植物不同組織。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種用金磁微粒純化植物組織基因組DNA的方法，包括以下步驟：

1)制備含有基因組DNA的樣品裂解液

取植物組織樣本，分別加入100～800μl的兩種裂解液，其中第一種裂解液中含有質(zhì)量體積比為2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和體積分?jǐn)?shù)為0.5％～2％β-巰基乙醇，第二種裂解液中含有3～6M鹽酸胍、體積分?jǐn)?shù)為2％～5％Triton?X-100；混勻后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml?RNase溶液，得到含有基因組DNA的樣品裂解液；(“質(zhì)量體積比”的單位即g/ml，表示溶質(zhì)的質(zhì)量與該種裂解液的體積的比)

2)用氯仿抽提后離心

用0.6ml～1.2ml氯仿在所述樣品裂解液中進(jìn)行樣本抽提，然后8000rpm～13000rpm離心5min，得到含有基因組DNA的上清；

3)結(jié)合

取400～1000μg金磁微粒與含有基因組DNA的上清混合，在結(jié)合緩沖液的作用下，形成含有金磁微粒-基因組DNA復(fù)合物的溶液；

4)清洗

對(duì)含有金磁微粒-基因組DNA復(fù)合物的溶液進(jìn)行磁性分離，棄去上清液，再加入清洗液混勻，磁性分離，棄上清，得到金磁微粒-基因組DNA復(fù)合物；

5)洗脫

將洗脫液與金磁微粒-基因組DNA復(fù)合物混勻，使基因組DNA從金磁微粒上轉(zhuǎn)到洗脫液中，磁性分離直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即為純化得到的基因組DNA溶液。

上述步驟1)中所述第一種裂解液中含有質(zhì)量體積濃度為2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和體積分?jǐn)?shù)為0.5％～2％β-巰基乙醇，第二種裂解液中含有3～6M鹽酸胍、體積分?jǐn)?shù)為2％～5％Triton?X-100以及0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M?NaCl和0.05～0.2M?Tris-HCl。

上述步驟3)中的結(jié)合緩沖液優(yōu)選聚乙二醇與氯化鈉的混合溶液，其中氯化鈉的終濃度為1M～3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000～10000之間，濃度為10％～30％；也可以選擇公知的其他結(jié)合緩沖液。

上述步驟5)中所述洗脫液優(yōu)選含有10mM?Tris-HCl和1mM?EDTA、pH＝8.0的TE溶液或無(wú)核酶水。

上述步驟2)采用氯仿只需進(jìn)行一次樣本抽提。

上述步驟4)中所述清洗液可以采用50％～85％的乙醇。

上述步驟1)中所述水浴的最佳溫度為50～65℃。

本發(fā)明通過(guò)采用兩種裂解液搭配使用，無(wú)需分步裂解組織，極大程度的滿(mǎn)足對(duì)多種植物及其不同部位基因組DNA的提取。