[發明專利]一種用于沙門菌快速檢測的Nano/ALISA方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201110315673.2
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN102565389A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 呂建新;吳文鶴;張杰
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/532;G01N21/31;G01N21/33
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技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及利用適配體代替抗體進行沙門菌捕獲和以納米金偶聯體作為信號報告基團，特別涉及應用該技術建立的一種基于納米/適配體聯合免疫吸附法(nano/aptamer-linked?immobilized?sorbent?assay，Nano/ALISA)的新型沙門菌快速檢測方法及用于沙門菌快速檢測的試劑盒。

背景技術

沙門菌(Salmonella)為常見的人畜共患病原菌，廣泛存在于各類動物的腸道內，以及被動物糞便污染的水和土壤中，可導致腸炎、腸熱癥甚至敗血癥等。它的感染發病占細菌性食物中毒的主要地位，由其引起的傷寒病已被我國《傳染病防治法》列入乙類傳染病之一，在發展中國家和發達國家都仍然是嚴重的公共衛生問題。美國每年報道的沙門菌感染約有四萬例，但由于許多感染者沒有就醫和報告，實際感染者數是這個數字的20倍以上。2008年9月美國發生了由鼠傷寒沙門菌導致的“花生醬中毒事件”，這是美國10年來最嚴重的沙門菌病疫情，導致了美國歷史上最大的食品召回事件，并迫使奧巴馬政府對現行的食品安全法進行修正。在我國，特別是廣大農村基層，因沙門菌引起的感染時有發生，其傳播速度快、波及面廣，一旦發生，很容易引起擴散流行。張肅等對1985年～2000年我國食物中毒情況重點分析，在微生物性食物中毒的發病人數中，沙門菌最為嚴重；王世杰等對1994年～2003年我國766起細菌性食物中毒的分析結果顯示，沙門菌居第二位。沙門菌對人類的健康構成威脅，而且也給國家帶來沉重的經濟負擔，故對沙門菌暴發的預防，以及對第一例病例的快速確診并對可疑病員進行排查，作到早發現、早治療、早隔離、快速查找傳染源、切斷傳播途徑等對控制本病極為重要。

目前沙門菌的實驗室檢測仍以檢出病原菌為主要依據，其檢測程序包括標本采集接種、分離培養、生化鑒定，血清學分型等多個環節，最快也要四到八天才能作出最終檢驗診斷。近年來，世界各地學者針對沙門菌的快速檢測技術展開了大量研究工作，利用特異的生物識別元件來進行快速診斷，如分子生物學和免疫學檢測技術等。通過聚合酶鏈反應(polymerase?chain?reaction，PCR)可以把痕量的遺傳物質迅速擴增百萬倍，使原本無法進行的各種分析檢測項目得以實施。但PCR往往需要先提取沙門菌的DNA或RNA，利用已報道的特異引物進行擴增，根據擴增結果可以進行定性或定量檢測，可以檢測＜100CFU的沙門菌。雖然PCR具有快速、靈敏、特異等優點，但是在檢測沙門菌方面仍有缺陷，如需要專業人員操作，所用的試劑和儀器昂貴，檢測結果假陽性高等，都是研究者們面臨的難題。免疫學檢測技術則利用抗原和抗體之間的特異性反應實現沙門菌的快速檢測，最常用的為酶聯免疫吸附技術(enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)，已報道的檢測靈敏度為10⁵CFU?ml^-1。ELISA技術自20世紀70年代出現以來，就因其特異性高、敏感性強、簡單快速，不需要昂貴儀器設備，特別適合于對大量樣本的篩檢工作等優點而備受關注。此外，免疫磁分離(immunomagnetic?separation)技術能在各種樣品中捕獲特異菌體，起到濃縮的作用，往往與ELISA技術聯用。但是ELISA技術的靈敏度和特異性往往依賴于抗體和抗原之間親和力的大小，且抗體具有制備困難、標記繁瑣、容易變性等缺點，這都是我們需要改進的關鍵；另外，ELISA檢測的目標難以像核酸一樣直接通過PCR進行擴增，所以信號放大效率受到了很大限制，而沙門菌在實際樣本中往往濃度較低。因此，迫切需要發展新的簡便、快速、靈敏的方法來滿足對沙門菌的檢測。