[發(fā)明專利]一種人類線粒體DNA純化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110315665.8
• 申請(qǐng)日: 2011-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN102417903A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管敏鑫;龔莎莎;鄭靜;張婷;方芳;鄭斌嬌;梁敏;呂建新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)核酸提取純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人類線粒體DNA純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

線粒體被譽(yù)為“生命的發(fā)動(dòng)機(jī)”，它在生命的發(fā)生、發(fā)展和延續(xù)過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，與細(xì)胞核DNA(nuclear?DNA，nDNA)相比，線粒體DNA(mitochondrial?DNA，mtDNA)具有不同的分子結(jié)構(gòu)和遺傳密碼。人類mtDNA呈共價(jià)閉合、環(huán)狀、雙鏈結(jié)構(gòu)，由16569個(gè)堿基對(duì)(base?pair，bp)組成，編碼了37個(gè)與電子傳遞鏈和線粒體蛋白合成相關(guān)的基因。圍繞線粒體開展的疾病發(fā)生、細(xì)胞凋亡及生物進(jìn)化研究已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

從細(xì)胞中獲取高純度的mtDNA是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作。傳統(tǒng)的細(xì)胞mtDNA制備方法大致分為兩種：一是先提取基因組DNA，再通過氯化銫密度梯度離心或柱層析法分離mtDNA；二是先將細(xì)胞充分勻漿，經(jīng)差速離心分離出線粒體，再用DNA酶降解nDNA，然后用蛋白酶或堿裂解線粒體而提取mtDNA。在國內(nèi)，為了克服傳統(tǒng)方法設(shè)備和試劑昂貴，操作程序繁鎖等缺點(diǎn)，胡義德等通過改進(jìn)堿變性法提取了人外周血白細(xì)胞中的mtDNA(公開號(hào)：101338310)；戴紀(jì)剛等建立了Triton法，先除去細(xì)胞核，再分離提取細(xì)胞漿中的mtDNA(戴紀(jì)剛等.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).Vol.22，No.4：391-392)；韓東一等通過添加蛋白質(zhì)變性劑，改進(jìn)了高鹽法(公開號(hào)：101250522)。以上方法盡管能獲得較高濃度的mtDNA，但仍存在一定缺陷，以nDNA殘余最為突出，嚴(yán)重的nDNA殘余阻礙了相關(guān)技術(shù)在mtDNA研究領(lǐng)域的應(yīng)用，例如：nDNA中存在大量的mtDNA假基因，若無法去除這些假基因的干擾，則會(huì)嚴(yán)重影響微量細(xì)胞mtDNA的分析。本發(fā)明將對(duì)以往的mtDNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)，旨在減少mtDNA溶液中的nDNA殘余。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種人類mtDNA純化方法。

本發(fā)明利用人類mtDNA和nDNA在核苷酸序列和分子構(gòu)型上的差異，通過限制性內(nèi)切酶Bgl?II和Dra?III特異性切割nDNA，核糖核酸酶A(Ribonuclease?A，RNase?A)和核酸外切酶III(ExonucleaseIII，ExoIII)進(jìn)一步消化核酸片段，降解人類基因組DNA或粗提取mtDNA溶液中的nDNA和RNA殘余，從而獲得高純度的mtDNA。

一種人類mtDNA純化方法，包括以下步驟：

(1)人類基因組DNA提取或mtDNA粗提取：可根據(jù)樣本來源不同，選擇不同的常規(guī)mtDNA提取方法。

(2)構(gòu)建酶切反應(yīng)體系，酶切nDNA、去除RNA殘余：向約含有4μg?DNA的全基因組DNA溶液或mtDNA粗提取中加入20μg?RNase?A、20U?Bgl?II、40UDra?III、10μL?10×緩沖液I、0.4μL?100×BSA，ddH₂O定容至100μL，用移液器溫和吹吸混勻，37℃溫浴2個(gè)小時(shí)。反應(yīng)體系可視底物濃度作適當(dāng)調(diào)整，為保證酶切效果，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。

(3)消化nDNA：向上述反應(yīng)液中加入200U?Exo?III，溫和吹吸混勻，37℃溫浴2個(gè)小時(shí)(可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間)，65℃溫浴10min終止反應(yīng)。

(4)酚-氯仿-異戊醇抽提mtDNA：在上述反應(yīng)液中加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g轉(zhuǎn)速下離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至新離心管并加入2倍于其體積的無水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g轉(zhuǎn)速下離心30min，棄上清，用70％乙醇洗滌，4℃、13,000×g轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，室溫干燥沉淀20min，用100μL?EB溶液溶解DNA沉淀，-20℃保存。

本發(fā)明一種人類mtDNA純化方法，其中所述步驟(2)和步驟(3)之間還可插入酚-氯仿-異戊醇抽提步驟以提高步驟(3)中Exo?III的反應(yīng)活性：在步驟(2)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g轉(zhuǎn)速下離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至新離心管并加入2倍于其體積的無水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g轉(zhuǎn)速下離心30min，棄上清，用70％乙醇洗滌，4℃、13,000×g轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，室溫干燥沉淀20min，用80μL?ddH₂O溶液溶解DNA沉淀。