[發明專利]一種人類線粒體DNA純化方法

無效

• 申請號: 201110315665.8
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN102417903A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 管敏鑫;龔莎莎;鄭靜;張婷;方芳;鄭斌嬌;梁敏;呂建新
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人類線粒體DNA純化方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)人類基因組DNA提取或線粒體DNA粗提取。

(2)構建酶切反應體系，酶切細胞核DNA，去除RNA殘余：向全基因組DNA溶液或線粒體DNA粗提取液(約含有4μg?DNA)中加入20μg?RNase?A、20U?Bgl?II、40U?Dra?III、10μL?10×緩沖液I、0.4μL?100×BSA，ddH₂O定容至100μL，用移液器溫和吹吸混勻，37℃溫浴2個小時。

(3)消化細胞核DNA：向上述反應液中加入200U?Exo?III，溫和吹吸混勻，37℃溫浴2個小時，65℃溫浴10min終止反應。

(4)酚-氯仿-異戊醇抽提線粒體DNA：在上述反應液中加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g轉速下離心15min，將水相轉移至新離心管并加入2倍于其體積的無水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g轉速下離心30min，棄上清，用70％乙醇洗滌，4℃、13,000×g轉速下離心5min，棄上清，室溫干燥沉淀20min，用100μL?EB溶液溶解DNA沉淀，-20℃保存。

2.根據權利要求1所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：步驟(1)中所述的人類基因組DNA提取或線粒體DNA粗提取，可根據樣本來源不同，選擇不同的常規mtDNA提取方法。

3.根據權利要求1所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：步驟(2)中所述的Bgl?II和Dra?III是兩種限制性內切酶，它們特異性作用于細胞核DNA，而不會對線粒體DNA產生影響。

4.根據權利要求1所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：步驟(2)中所述的10×緩沖液I的配方為：100mmol/L?NaCl，50mmol/L?Tris-HCl，10mmol/L?MgCl₂，1mmol/L?DTT，25℃?pH?7.9。

5.根據權利要求1所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：在步驟(2)和步驟(3)之間還可插入另外一個步驟，以提高步驟(3)中Exo?III的反應活性。

6.根據權利要求1和5所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：所述另外一個步驟是在步驟(2)的反應產物中加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g轉速下離心15min，將水相轉移至新離心管并加入2倍于其體積的無水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g轉速下離心30min，棄上清，用70％乙醇洗滌，4℃、13,000×g轉速下離心5min，棄上清，室溫干燥沉淀20min，用80μL?ddH₂O溶液溶解DNA沉淀。

7.根據權利要求1、5和6所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：在步驟(2)和步驟(3)中插入權利要求5所述的步驟后，步驟(3)需為另外一個步驟所代替。

8.根據權利要求1、5、6和7所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：所述另外一個步驟是在權利要求6所述的80μL反應液中加入200U?Exo?III、10μL?10×緩沖液II，ddH₂O補充體積至100μL，溫和吹吸混勻，37℃溫浴2個小時，65℃溫浴10min終止反應。

9.根據權利要求8所述的人類線粒體DNA純化方法，其特征在于：所述10×緩沖液II的配方為：10mmol/L?Tris-HCl，10mmol/L?MgCl₂，1mmol/L?DTT，25℃pH?7.0。

10.一種在權利要求1-9中任一項所述的人類線粒體DNA純化方法中使用的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1-7中任一項所述的方法中使用的全部試劑，且按照使用的順序排列。

11.權利要求1-9任一項所述的人類線粒體DNA純化方法在人類線粒體DNA提取中的應用。

12.權利要求10所述的試劑盒在人類線粒體DNA提取中的應用。