[發(fā)明專利]強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110315641.2
• 申請日: 2011-10-17
• 公開（公告）號: CN103045710A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 元英進;鄒旸;呂亞金;胡夢龍;汪洋
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P7/60;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領域，涉及一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法。

背景技術

維生素C是機體營養(yǎng)、生長所必需的一種微量水溶性維生素，在抗氧化和維持新陳代謝平衡等方面起著重要的作用。維生素C可以作為藥品、保健品、食品添加劑及化妝品營養(yǎng)劑，它的應用范圍在擴展，市場穩(wěn)定。

目前，我國生產維生素C的方法為“二步發(fā)酵法”，第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為混合發(fā)酵，將山梨糖轉化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)?；旌习l(fā)酵所使用的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)混菌發(fā)酵，其中，氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)為產酸菌，巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)為伴生菌，若不加入巨大芽孢桿菌而單獨使用氧化葡糖桿菌時，生長極端緩慢，產酸效率低，當加入巨大芽孢桿菌，可使氧化葡糖桿菌生長速率提高，產酸量增加，但是，巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)混菌發(fā)酵2-酮基-L-古龍酸的轉化率尚有可提高的空間。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法。

強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法，包括如下步驟：

(1)固體培養(yǎng)：

取存于液氮的10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35℃，培養(yǎng)24-48小時；

(2)種子培養(yǎng)：

將經步驟(1)培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養(yǎng)基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)，24h-48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以24h-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-200天；

(3)分純：

將步驟(2)獲得的傳代培養(yǎng)混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35℃培養(yǎng)24-48小時；再分別轉入種子培養(yǎng)基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；

(4)發(fā)酵：

將所述進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h-96h，獲得2-酮基-L-古龍酸或將所述原始巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使原始巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁷-2×10⁹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h-96h，獲得2-酮基-L-古龍酸。

固體培養(yǎng)基的制備為：按比例稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，瓊脂10-50g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，調pH為6.5-7.0，121℃滅菌20min，制成固體培養(yǎng)基。