[發明專利]強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法

無效

• 申請號: 201110315641.2
• 申請日: 2011-10-17
• 公開（公告）號: CN103045710A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 元英進;鄒旸;呂亞金;胡夢龍;汪洋
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P7/60;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法，其特征是包括如下步驟：

(1)固體培養：

取10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養基上，28-35℃，培養24-48小時；

(2)種子培養：

將經步驟(1)培養的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養，24h-48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養，以24h-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養基中，傳代100-200天；

(3)分純：

將步驟(2)獲得的傳代培養混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養基上，28-35℃培養24-48小時；再分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；

(4)發酵：

將所述進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌接種到發酵培養基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養72h-96h，獲得2-酮基-L-古龍酸或將所述原始巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌接種到發酵培養基中，使原始巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁷-2×10⁹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養72h-96h，獲得2-酮基-L-古龍酸。

2.根據權利要求1所述的一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法，其特征是所述固體培養基的制備為：按比例稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，瓊脂10-50g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，調pH為6.5-7.0，121℃滅菌20min，制成固體培養基。

3.根據權利要求2所述的一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法，其特征是所述固體培養基的制備為：按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，瓊脂20g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCO₃1g，加水至1L，調pH為6.8，121℃滅菌20min，制成固體培養基。

4.根據權利要求1所述的一種強化兩菌相互作用提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法，其特征是所述種子培養基制備為：按比例稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，調pH為6.5-7.0，121℃滅菌20min，制成種子培養基。