[發明專利]一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實時熒光定量RT?PCR方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201110312855.4
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN103045754B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 馬志永;史子學;魏建超;邵東華;王少輝;李蓓蓓;劉陽
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司31002
• 代理人: 朱水平,沈利

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，特別涉及一種一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒和引物與探針。

背景技術

埃博拉出血熱(Ebola?hemorrhagic?fever，EHF)是由埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)引起的，主要以人和非人類靈長類動物為易感動物的急性出血性傳染病。該病1976年首次發生于埃博拉河流域的剛果民主共和國(前扎伊爾)，因感染者全身呈出血癥狀，故命名為埃博拉出血熱。據推測最初人類感染EBOV主要是因為人類接觸感染了病毒的動物宿主或者間接宿主的身體。在這之后人與人之間通過直接接觸已經感染了病毒的人的身體進行傳播。在經歷一段2-21天的潛伏期之后，感染病毒的病人就會出現一些發熱的癥狀。EHF的主要特征是迅速發熱，寒冷，頭痛和肌肉疼痛，之后會產生咽喉腫痛，惡心，嘔吐，腹瀉以及腹痛。大約一半的病人會出現出血癥狀，例如從鼻孔出血，出現血尿或者是胃腸出血和陰道出血。EHF目前為止主要呈現地方性流行，絕大部分集中于非洲。非洲以外地區偶有病例報道，均屬于輸入性或實驗室意外感染，未發現有EHF流行。EBOV已經被證實是通過體液傳播的，如口腔和結膜接觸傳播，這在非人靈長類動物試驗已確證。自然界的動物各種行為和其它因素都有可能造成EBOV的爆發。為了防止EBOV進入我國，對我國的經濟以及人身安全造成嚴重的損失，目前我國急需建立一種快速、準確、敏感的檢測方法。

EHF的病原是EBOV，屬于絲狀病毒科(Filoviridae)絲狀病毒屬(Filovirus)成員，是非分節段的單股負鏈RNA病毒。目前已鑒定的埃博拉病毒有5種亞型，分別是：EBOV-扎伊爾型(Ebola-Zaire，簡稱EBOV-Z)，EBOV-蘇丹型(Ebola-Sudan簡稱EBOV-S)，EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo，簡稱EBOV-B)，EBOV-科特迪瓦型(Ebola-Ivory?Coast，簡稱EBOV-C)，EBOV-萊斯頓型(Ebola-Reston，簡稱EBOV-R)。感染EBOV-Z，EBOV-S和EBOV-B的致死率大約在25％-90％。目前，EHF大爆發幾乎都是由EBOV-Z和EBOV-S引起的。這兩種亞型病毒的所造成的死亡人數占由EBOV所造成的死亡人數的98％以上，所以對Z/S兩種亞型的檢測方法建立成為EBOV防控的重點。

熒光定量RT-PCR具有快速、敏感和高通量的特點，一步法熒光定量RT-PCR方法還能降低殘留污染，并且熒光定量RT-PCR方法已作為多種病毒的檢測方法。在EBOV的檢測方法研究領域，IgG-捕獲ELISA和IgM-捕獲ELISA是僅有的兩類常用檢測方法，建立一種敏感、特異的熒光定量RT-PCR方法對EBOV的防控具有重要的實踐意義。

經對現有技術的文獻檢索發現，國內沒有EBOV檢測技術的專利公布。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對沒有EBOV熒光定量PCR檢測技術的問題，提供一種在一次檢測中即可對Z/S兩種亞型埃博拉病毒進行檢測的實時熒光定量RT-PCR的檢測方法及其試劑盒。該方法檢測的敏感性可達到100個拷貝的病毒RNA分子，對于單個樣本檢測小于1.5個小時，操作簡易，可以進行高通量的樣品檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的。

本發明的技術方案一為，一種特異性擴增Z/S亞型埃博拉病毒的引物對，所述的引物長度25±5nt，其中一條引物含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標志序列的差異位點相同，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標志序列相同；另一條引物也含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標志序列的差異位點互補，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標志序列互補；該引物對的擴增片段為70-300bp，優選196bp。

優選的，所述的引物對中，一條是SEQ?ID?NO：16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ?ID?NO：17所示序列的核苷酸。