[發(fā)明專利]一步法檢測(cè)Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR方法及其試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110312855.4
• 申請(qǐng)日: 2011-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN103045754B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬志永;史子學(xué);魏建超;邵東華;王少輝;李蓓蓓;劉陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司31002
• 代理人: 朱水平,沈利

1.一種檢測(cè)Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒一引物對(duì)和一探針；所述的引物對(duì)中，引物長(zhǎng)度25±5nt，其中一條引物含有一個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同；另一條引物也含有一個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)；該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為70-300bp；所述的探針長(zhǎng)度為18±5nt，該探針含有一個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡(jiǎn)并堿基分別和本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物對(duì)中，一條是SEQ?ID?NO：16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ?ID?NO：17所示序列的核苷酸。

3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針為MGB探針。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針的序列為SEQID?NO：18。

5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括：陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、RNA提取試劑和熒光定量反應(yīng)液。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dUTPs溶液、AMV酶、Taq?DNA聚合酶、無菌雙蒸水和MgCl2溶液。

7.一種檢測(cè)Z/S亞型埃博拉病毒的探針，其特征在于，所述的探針長(zhǎng)度為18±5nt，該探針含有一個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡(jiǎn)并堿基分別和本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對(duì)在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。

8.如權(quán)利要求7所述的探針，其特征在于，所述的探針的序列為SEQ?IDNO：18。

9.一種一步法檢測(cè)Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待檢樣品的RNA；

2)將上述RNA加入熒光定量反應(yīng)液中，采用如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒中的引物對(duì)以及探針，用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；

3)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對(duì)待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。

10.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒在常規(guī)非生物安全P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)Z/S兩種亞型埃博拉病毒的應(yīng)用。