[發(fā)明專利]乙酰膽堿酯酶的固定化方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110312502.4
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102409037A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 夏玉先;周小霞
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶大學;中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種酶的固定化方法和應用，具體地說，是將重組乙酰膽堿酯酶固定到Ni-NTA樹脂上制成固定化乙酰膽堿酯酶的方法及其應用。

背景技術(shù)

乙酰膽堿酯酶(AChE)是一種重要的水解酶。它能夠選擇性地催化底物乙酰膽堿水解，其催化活性能被有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥所抑制。利用這一特性乙酰膽堿酯酶可用于檢測有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥。因而，AChE在環(huán)保、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、軍事等領域具有重要用途。但是游離酶性質(zhì)不穩(wěn)定，極易失活，不能重復使用。與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性強，重現(xiàn)性好，能重復使用等優(yōu)點。因此，酶的固定化技術(shù)研究已成為酶工程的重要組成部分。

目前，乙酰膽堿酯酶的固定化方法有吸附法、包埋法和交聯(lián)法。吸附法根據(jù)物理吸附原理將乙酰膽堿酯酶吸附于載體上，此法的優(yōu)點是方法簡單易行，酶活保存完好。但是由于物理吸附作用力弱，因此采用吸附法固定的乙酰膽堿酯酶易流失，酶活下降快。包埋法將乙酰膽堿酯酶包裹在聚合物網(wǎng)格中，雖然解決了酶流失問題，但是，苛刻的聚合條件會使乙酰膽堿酯酶失活，并且包埋在聚合物深處的乙酰膽堿酯酶難于發(fā)揮作用。交聯(lián)法采用雙功能試劑將酶以共價鍵的形式牢固地連接到載體上，但是劇烈的化學反應仍然會使乙酰膽堿酯酶失活。因此尋找到合適的載體材料，研發(fā)出酶活性高、穩(wěn)定性好、易于保存的固定化重組乙酰膽堿酯酶是相關(guān)產(chǎn)業(yè)部門十分期望的。

Ni-NTA樹脂(His標簽純化樹脂)是用于純化His標簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由4％交聯(lián)的凝膠耦連了一種四齒螯合劑NTA而得，帶有Ni²⁺。目前，Ni-NTA樹脂已被用來純化含有組氨酸標簽的重組乙酰膽堿酯酶，即將重組蛋白和經(jīng)處理的Ni-NTA樹脂混合后，利用親和層析進行結(jié)合、洗滌、洗脫以純化重組蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用Ni-NTA樹脂制備固定化重組乙酰膽堿酯酶的方法。

發(fā)明人在長期研究過程中，意外發(fā)現(xiàn)不進行洗滌、洗脫步驟能使含有組氨酸標簽的重組乙酰膽堿酯酶有效地固載到Ni-NTA樹脂上，直接用于酶活測定、抑制劑篩選和農(nóng)藥殘留檢測，并具有乙酰膽堿酯酶活性高、穩(wěn)定性好、易于保存等優(yōu)點。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)：

一種制備固定化重組乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于：

A.原料準備

采用基因工程技術(shù)獲得帶有組氨酸標簽的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液；

用緩沖液洗滌Ni-NTA樹脂，離心處理；

B.將步驟A中制得的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液和處理后的Ni-NTA樹脂混合，離心處理。

上述的基因工程技術(shù)是指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學操作。步驟包括：

(1)DNA片段的取得，即目的基因的分離和制備

(2)DNA片段和載體的連接，制得重組體DNA

(3)外源重組DNA片段導入宿主細胞

(4)選擇

(5)目的基因表達

發(fā)明人在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，在使用基因工程技術(shù)制備重組乙酰膽堿酯酶過程中，限制性內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體、感受態(tài)細胞、宿主的選擇也很重要，這些因素的合理選擇與配合可進一步影響固定化乙酰膽堿酯酶的制備。

優(yōu)選地，上述宿主是畢赤酵母Pichia?pastoris?KM71。

更優(yōu)選地，上述重組DNA制備中感受態(tài)細胞是大腸桿菌JM109菌株。

最優(yōu)選地，上述目的基因分離和制備中目的基因引入的限制性內(nèi)切酶位點是EcoR?I，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體是pPIC9K，使重組表達質(zhì)粒載體線性化的限制性內(nèi)切酶是Sal?I。

發(fā)明人同時發(fā)現(xiàn)在利用此法制備固定化重組乙酰膽堿酯酶過程中，Ni-NTA樹脂與酶液的用量，離心速度和時間，對固定化乙酰膽堿酯酶的制備效果有進一步的影響。

優(yōu)選地，上述重組乙酰膽堿酯酶粗酶液的總蛋白含量為500μg·ml^-1及以上，粗酶液與處理后的Ni-NTA樹脂按3∶1的體積比混合。

更優(yōu)選地，上述緩沖液的配方是300mM?NaCl，50mM?Na3PO4，10mM咪唑，pH?7.4。

進一步優(yōu)選地，上述緩沖液用量是Ni-NTA樹脂體積的5倍。最優(yōu)選地，上述離心操作的轉(zhuǎn)速為3000rpm，時間為30秒鐘。

具體地說，基因工程技術(shù)的操作步驟如下：