[發明專利]乙酰膽堿酯酶的固定化方法和應用

有效

• 申請號: 201110312502.4
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102409037A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 夏玉先;周小霞
• 申請（專利權）人: 重慶大學;中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.?一種制備重組乙酰膽堿酯酶固定化載體的方法，特征在于，采用如下步驟制備：

A．原料準備

采用基因工程技術獲得帶有組氨酸標簽的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液；?

用緩沖液洗滌Ni-NTA樹脂，離心處理；

B．將步驟A中制得的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液和處理后的Ni-NTA樹脂混合，離心處理。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的基因工程技術包括目的基因的分離和制備、重組體DNA的制備、外源重組DNA片段導入宿主細胞等步驟；

所述宿主是畢赤酵母Pichia?pastoris?KM71。

3.如權利要2所述的方法，其特征在于：所述重組體DNA的制備中，采用的感受態細胞是大腸桿菌JM109菌株。

4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述目的基因分離和制備中目的基因引入的限制性內切酶位點是EcoR?I，轉移質粒載體是pPIC9K，使重組表達質粒載體線性化的限制性內切酶是SalⅠ。

5.?如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重組乙酰膽堿酯酶粗酶液的總蛋白含量為500?mg·ml^-1以上，粗酶液與處理后的Ni-NTA樹脂按3：1的體積比混合。

6.?如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟A中緩沖液的配方是300?mM?NaCl，50?mM?Na3PO4，10?mM?咪唑，pH?7.4。

7.如權利要求1、2或5所述的方法，其特征在于：所述緩沖液用量是Ni-NTA樹脂體積的5倍。

8.如權利要求1、2、5或6所述的方法，其特征在于：所述離心的轉速為3000rpm，時間為30秒。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

A．原料準備

采用基因工程技術獲得帶有組氨酸標簽的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液，所述的基因工程技術包括目的基因的分離和制備、重組體DNA的制備、外源重組DNA片段導入宿主細胞等步驟；所述宿主是畢赤酵母Pichia?pastoris?KM71；所述重組體DNA的制備中，采用的感受態細胞是大腸桿菌JM109菌株；所述目的基因分離和制備中目的基因引入的限制性內切酶位點是EcoR?I，轉移質粒載體是pPIC9K，使重組表達質粒載體線性化的限制性內切酶是SalⅠ，用5倍體積的緩沖液（300?mM?NaCl，50?mM?Na3PO4，10?mM咪唑，pH?7.4）洗滌樹脂三遍，以3000rpm轉速離心30秒，棄上清；

B．將步驟A中制得的重組乙酰膽堿酯酶粗酶液和處理后的Ni-NTA樹脂按3：1的體積比混合，離心處理，重組乙酰膽堿酯酶粗酶液的總蛋白含量為500?mg·ml-1。