[發明專利]PCV2重組桿狀病毒構建及其亞單位疫苗制備方法

無效

• 申請號: 201110312284.4
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102352347A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 張鵬超;沈元;嵇康;孟超
• 申請（專利權）人: 浙江諾倍威生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/63;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

技術領域

本發明涉及一種PCV2重組構建及其亞單位疫苗制備方法，具體說是指一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構建及其亞單位疫苗制備方法，屬生物技術領域獸用生物制品行業。?

背景技術

豬圓環病毒(Porcine?circovirus，PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus)，無囊膜，是目前發現的最小的動物病毒。根據致病性、抗原性和核酸序列的差異，將PCV可分為PCV-1和PCV-2。PCV-1尚未知有致病性；PCV-2具有致病性，能引起豬表現多種臨床癥狀。PCV-1基因組全長1759bp，PCV-2全長1768bp或1767bp，二者序列同源性小于80％。現已經證實，PVC有兩個主要的閱讀框，ORF1和ORF2。ORF1是最大的閱讀框，與病毒的復制轉錄有關。ORF2編碼病毒的Cap蛋白，可以與PCV-2的抗血清反應，是主要的免疫原。?

豬圓環病毒現已成為全球廣泛傳播的豬病病毒，其具有流行范圍廣、各生長階段豬感染嚴重、混合感染突出等特點。PCV2在我國的流行始于2000年，在我國該病毒的陽性率也呈逐年上升的趨勢，2001-2002年在我國華南地區出現過一次爆發高潮，目前在許多省份危害嚴重，給我國養豬業造成了巨大的損失，嚴重威脅了我國養豬業的發展。?

目前世界上研發的圓環病毒疫苗主要種類有：PCV2全病毒滅活疫苗CIRCOVAC；PCV1-PCV2嵌合病毒滅活疫苗SuvaxynPCV2；桿狀病毒表達多肽PCV2基因工程疫苗CircoFLEX和PorcilisPCV，其中SuvaxynPCV2是第一個在美國獲得了完整許可證的疫苗。?

與其他表達系統相比，桿狀病毒表達系統具有以下的優越性：桿狀病毒的衣殼和基因組大，可容納10kb左右外源DNA且不影響復制，還可同時進行多個外源片段的表達；應用晚期蛋白啟動子，即使外源基因產物對細胞有毒性，也不影響表達水平(韓慶功、崔艷紅、劉寶國.昆蟲桿狀病毒表達系統在禽流感病毒研究中的應用.吉林農業科學.2010，35(1)：38-41，44.)；桿狀病毒具有明顯的宿主界限，對脊椎動物無致病性，也不能在脊椎動物細胞內復制表達更不能整合，因此對眾多生物具有很高安全性；多角體蛋白與p10基因是非必需片段，啟動子均很強；外源基因插入多角體蛋白基因的座位引起后者的缺失或失活，無多角體蛋白形成，從而導致重組病毒在自然環境下極易失活，不會造成對人的危害和對環境的污染；昆?蟲細胞作為真核細胞能完成外源蛋白的一系列轉譯后加工修飾，表達產物的理化和生物學特性與天然產物相似度很高；其病毒在昆蟲細胞內產量高，因此可以高效表達轉座基因蛋白。此外，昆蟲細胞的無血清培養技術已經十分成熟，表達產物的下游處理更加方便。?

利用傳統的豬腎細胞培養技術生產圓環病毒滅活疫苗，病毒效價低，抗原含量不足，生物安全性差。利用桿狀病毒表達系統對PCV2?Cap蛋白進行高效表達，可得到更高含量的抗原蛋白，且下游處理工藝更加成熟，對圓環病毒流行的監測和防控都有巨大的應用價值。?

發明內容

為了解決和抑制豬圓環病毒的廣泛傳播，本發明的目的是提供一種更有效的預防豬圓環病毒2型感染的的豬圓環病毒2型Cap蛋白亞單位疫苗和其構建及生產方式，亦可制備PCV2特異性快速診斷用品。?

本發明所指PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒是：用分子生物學手段后獲得的含有密碼子優化后的PCV2?ORF2核苷酸序列(SEQ?ID?No.3)和氨基酸序列(SEQ?ID?No.4)能高效表達PCV2表面抗原(Cap蛋白)的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa?californica?multicapsid?nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)，本發明以下簡稱為PCV2重組桿狀病毒或重組桿狀病毒。?

本發明主要通過以下技術方案實施的：?

1.構建一株含SEQ?ID?No.3核苷酸序列和SEQ?ID?No.4氨基酸序列、能高效表達PCV2表面抗原(Cap蛋白)的PCV2重組桿狀病毒。?

2.本發明PCV2重組桿狀病毒的構建方法為：?