[發(fā)明專利]PCV2重組桿狀病毒構(gòu)建及其亞單位疫苗制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110312284.4
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102352347A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鵬超;沈元;嵇康;孟超
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/63;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

1.一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒，其特征在于該P(yáng)CV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒含SEQ?ID?No.3核苷酸序列和SEQ?ID?No.4氨基酸序列、能高效表達(dá)PCV2Cap蛋白；該Bac/CY株病毒已于2011年09月26日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC?No.5267。

2.如權(quán)利要求1所述一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構(gòu)建，其特征在于重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的構(gòu)建主要步驟包括：

(1)以根據(jù)文獻(xiàn)中ORF2基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增PCV2?HZ株DNA為模板，以Seq-U(SEQ?ID?No.1.)和Seq-D(SEQ?ID?No.2)為引物，進(jìn)行PCV2-ORF2片段的PCR擴(kuò)增；

(2)將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至克隆載體pGEM-T上進(jìn)行鑒定；陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后連接到苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒穿梭載體pPAK/mod上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，提取高純度的質(zhì)粒pPAK/CY；

(3)將pPAK/CY質(zhì)粒與缺失ORF1629基因的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，篩選得到重組的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒；

(4)根據(jù)蝕斑克隆方法純化病毒，并感染Sf9-F細(xì)胞；通過血清免疫熒光方法鑒定篩選出高表達(dá)量的陽性Bac/CY株(CGMCC?No.5267)。

3.含有權(quán)利要求1所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的亞單位疫苗，其特征在于該亞單位疫苗的主要成分是由Bac/CY株P(guān)CV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(CGMCC?No.5267)所表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。

4.制備權(quán)利要求3一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，采用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞Sf9-F，培養(yǎng)環(huán)境為27℃120r/min，培養(yǎng)約48h其細(xì)胞處在對數(shù)生長期時將接入PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCCNo.5267，再經(jīng)過72h培養(yǎng)，收獲感染細(xì)胞，病毒效價能達(dá)到10^8.0TCID₅₀/ml以上，反復(fù)凍融3次，用PBS離心洗滌方法數(shù)次后取上清，上述重組蛋白提純加入常規(guī)疫苗佐劑并經(jīng)過乳化即成PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。

5.如權(quán)利要求4所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗制備方法，其特征在于，可以采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞Sf9-F以復(fù)制PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.5267，制備PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。

6.如權(quán)利要求4所述一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗制備方法，其特征在于，可以采用激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞Sf9-F以復(fù)制PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.5267，培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞至1～4x10⁶/ml，震蕩速度為80r/min，溶氧飽和度為60％，培養(yǎng)4～6天并收獲，制備PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。

7.權(quán)利1所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒，其特征在于其PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.5267表達(dá)的產(chǎn)物可用制備PCV2抗體診斷試劑盒。