[發明專利]一種慢病毒感染細胞的檢測方法

無效

• 申請號: 201110311138.X
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102367476A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 王志超
• 申請（專利權）人: 太湖瑞晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

????本發明涉及一種生物檢測方法，具體提供了一種慢病毒感染細胞的檢測方法。

背景技術

????核酸配基（Aptamer）就是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），由于其能與相應的靶分子高特異性和高親合力地結合，故也稱為核酸類抗體。核酸配基是從人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫中利用一種體外篩選和放大技術分離得到的、能特異性地與靶分子高效結合的寡核苷酸序列。用來獲取配基的這種體外篩選過程稱為指數富集配體的系統進化技術(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment,?SELEX)。

目前研究者們已從核酸文庫中篩選出多種與蛋白質、核酸、寡肽、氨基酸、有機物、金屬離子等特異結合的配基，這些成果多在從事基礎研究的實驗室取得的，其中包括中國國內的幾個Aptamer研究小組，如中科院長春應用化學所，湖南大學生物計量學實驗室，華東師范大學、陜西師范大學的電化學實驗室以及華中科技大學和軍事醫學院的一些小組。不過，核酸配基也在被應用于臨床診斷，如果在其結合后靶分子活性被抑制的話則也具備潛在的治療價值，如美國FDA批準OSI?Pharmaceuticals公司采用Macugen治療老年性黃斑變性（Age-related?macular?degeneration,?AMD),?而Archemix公司則正嘗試采用其專利核酸配基產品ARC1779治療包括急性冠脈綜合征(Acute?Coronary?Syndrome,?ACS)在內的多種急、慢性疾患，等等。而也有研究者利用牛痘病毒感染的人肺源性腫瘤細胞系A549來篩選核酸配基，得到了數種能被特異性識別的、牛痘病毒感染了的細胞系；這些核酸配基的靶分子可能是表達在細胞表面的病毒蛋白分子。

屬于VI型逆轉錄病毒的慢病毒亞群中的某些成員（如HIV）在感染宿主細胞后，能整合到不分裂的宿主細胞的基因組中而導致疾病發生。但目前對慢病毒感染細胞的檢測比較麻煩。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種慢病毒感染細胞的檢測方法，它能快速、簡便、有效地檢測被慢病毒感染了的人體組織細胞。

為解決上述技術問題，本發明慢病毒感染細胞的檢測方法為：

1）人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中隨機序列長度為20～40堿基，文庫容量在10E＾14～10E＾15之間；

2）以MOI=5感染HEK293細胞，室溫搖動孵育1小時以助細胞均勻地吸收病毒，在37℃、5%CO₂培養箱孵育12小時后吸棄細胞上培養基開始特異性配基篩選；

3）將隨機寡核苷酸文庫與位于慢病毒感染了的HEK293細胞表面的靶分子一起孵育,?于4?℃以120?rpm搖動培養1小時以助配基—配體充分結合；?孵育結束后以PBS洗滌單細胞層；

酶解收獲細胞，重懸細胞于0.5mlH₂O、95℃x5min以釋放被結合的寡核苷酸配基候選分子；釋放出的寡核苷酸配基候選分子，經PCR或者RT-PCR生成新的次一級文庫，再與該靶分子結合進行第二輪的篩選，如此反復若干循環，即可篩選出能與該靶子特異性結合的核酸配基；

4）將核酸配基用Cy5標記，并與慢病毒感染了的HEK293細胞一起孵育，洗滌后作流式細胞分析，以評估所篩選、富集核酸配基的活性；非標記的核酸配基競爭實驗以提高核酸配基的親和性及特異性；經鑒定的核酸配基隨后克隆至載體上測序分析。

本發明采用合成隨機寡核苷酸配基文庫、慢病毒感染HEK293細胞、篩選與慢病毒感染細胞特異性結合的配基，即采用慢病毒感染人源性細胞系后篩選特異性核酸配基，發現了新的慢病毒感染檢測方法，并探索利用這些核酸配基治療慢病毒感染的可能性。

與蛋白類抗體相比，核酸類抗體（配基）具有如下的優越性：在體外而非體內（動物、細胞）條件下篩選，特性可依要求改變；篩選條件不同而結果（目的物）不同，動力學參數可依體外診斷條件的要求而改變；克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；在體外化學合成，可以保證時間、質量和數量；特異性和親和力不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾；可以在合成時精確、定點，隨意連接其它功能基團和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶等；比抗體的分子小，方便體內影像診斷和治療；如接上硫代磷酸，可用于細胞內診斷和治療；變性與復性可逆且速度快，可反復使用、長期保存和室溫運輸。