[發(fā)明專利]一種慢病毒感染細(xì)胞的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110311138.X
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102367476A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王志超
• 申請（專利權(quán)）人: 太湖瑞晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?一種慢病毒感染細(xì)胞的檢測方法，其步驟為：

1）人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中隨機序列長度為20～40堿基，文庫容量在10E＾14～10E＾15之間；

2）以MOI=5感染HEK293細(xì)胞，室溫?fù)u動孵育1小時以助細(xì)胞均勻地吸收病毒，在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱孵育12小時后吸棄細(xì)胞上培養(yǎng)基開始特異性配基篩選；

3）將隨機寡核苷酸文庫與位于慢病毒感染了的HEK293細(xì)胞表面的靶分子一起孵育,?于4?℃以120?rpm搖動培養(yǎng)1小時以助配基—配體充分結(jié)合；?孵育結(jié)束后以PBS洗滌單細(xì)胞層；

酶解收獲細(xì)胞，重懸細(xì)胞于0.5mlH₂O、95℃x5min以釋放被結(jié)合的寡核苷酸配基候選分子；釋放出的寡核苷酸配基候選分子，經(jīng)PCR或者RT-PCR生成新的次一級文庫，再與該靶分子結(jié)合進(jìn)行第二輪的篩選，如此反復(fù)若干循環(huán)，即可篩選出能與該靶分子特異性結(jié)合的核酸配基；

4）將核酸配基用Cy5標(biāo)記，并與慢病毒感染了的HEK293細(xì)胞一起孵育，洗滌后作流式細(xì)胞分析，以評估所篩選、富集核酸配基的活性；非標(biāo)記的核酸配基競爭實驗以提高核酸配基的親和性及特異性；經(jīng)鑒定的核酸配基隨后克隆至載體上測序分析。