[發明專利]高通量的RSV蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110310517.7
• 申請日: 2011-10-13
• 公開（公告）號: CN103048450A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 彭祥翔;李少華;陸恒
• 申請（專利權）人: 上海藥明康德新藥開發有限公司;蘇州藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

技術領域

本發明涉及一種病毒滴度的定量檢測法，特別是涉及一種用于藥物篩選及生物樣品檢驗的RSV(Respiratory?Syncytial?Virus，呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法及其高通量檢測試劑盒。

背景技術

呼吸道合胞病毒(RSV)是在嬰兒時期和兒童早期導致支氣管炎和肺炎的主要原因。該病毒通常會引起再感染。再感染一般發生在成年人中。在老人和缺乏免疫力的病人當中，可能導致下呼吸道的嚴重疾病。通常病情會持續兩到三周.在嬰兒和有高風險病情的兒童中，RSV(呼吸道合胞病毒)感染可能會危及患者的生命。病毒性支氣管炎是一個嚴重的傳染病，據估計每年引起100萬人死亡，其中大多數病例是由RSV(呼吸道合胞病毒)引起的。出生后第一年，高達70％～80％比例的嬰兒將感染RSV(呼吸道合胞病毒)。目前尚無有效的疫苗或小分子藥物用來防治RSV(呼吸道合胞病毒)感染。因此，用快速、高效的方法來篩選獲得抗RSV(呼吸道合胞病毒)的有效藥物是研發新藥的有效手段。

在抗病毒藥物篩選方法中，目前主要使用細胞病變效應(CPE)法。其檢測方法有四甲基偶氮唑鹽(以下簡稱MTT)法，或者使用Cell?Counting?Kit-8(CCK-8試劑盒)進行檢測。其中，MTT法的檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。而CCK-8試劑盒是基于WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽】的檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚溶解在培養基中。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系，即生成的甲臜量與活細胞數量成正比。但這些CPE法靈敏度低，通量亦不適于大量化合物的篩選。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測抗原，后者用于測定特異性抗體。ELISA是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗方法，由于其試劑穩定、易保存、操作簡便、結果判斷較客觀等因素，具有適宜于大規模篩查試驗、又可以用于少量標本的檢測、既可以做定性試驗也可以做定量分析等優點，因此，具有廣泛的使用價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒。本發明改變了目前篩選抗病毒藥物的方法，提高了篩選通量，縮短了篩選周期(可以縮短60％以上的時間)，同時該方法也用于臨床或非臨床樣品的定量檢測。

為解決上述技術問題，本發明的用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法，包括步驟：

A、對于非臨床樣品，其檢測步驟，包括Hep2細胞的培養階段、RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟；

B、對于臨床或臨床前樣品，其檢測步驟，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟。

所述非臨床樣品包括：化合物；臨床樣品包括：患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；臨床前樣品包括：動物模型組織提取物等。

所述A中的Hep2細胞的培養階段，步驟包括：

①將Hep2細胞接種至細胞培養板中培養；其中，培養條件為37℃、5％CO₂、培養16-24小時；

②待檢測樣品(非臨床樣品，如化合物)加入上述接種有細胞的培養板中；

③加入RSV(呼吸道合胞病毒)至上述培養板中；

④培養板經培養96-120小時后，取細胞培養上清進行ELISA檢測。

所述細胞培養板是384孔培養板，接種的細胞密度控制在每孔1800-3000個細胞，體積為20-50μl；