[發明專利]高通量的RSV蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110310517.7
• 申請日: 2011-10-13
• 公開（公告）號: CN103048450A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 彭祥翔;李少華;陸恒
• 申請（專利權）人: 上海藥明康德新藥開發有限公司;蘇州藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

1.一種用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量檢測法，包括步驟：

A、對于非臨床樣品，其檢測步驟，包括Hep2細胞的培養階段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟；

B、對于臨床或臨床前樣品，其檢測步驟，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟。

2.如權利要求1所述的定量檢測法，其特征在于：所述非臨床樣品包括：化合物；

臨床樣品包括：患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；

臨床前樣品包括：動物模型組織提取物。

3.如權利要求1所述的定量檢測法，其特征在于：所述A中的Hep2細胞的培養階段，步驟包括：

①將Hep2細胞接種至細胞培養板中培養；其中，培養條件為37℃、5％CO₂、培養16-24小時；

②將非臨床樣品加入上述接種有細胞的培養板中；

③加入呼吸道合胞病毒RSV至上述培養板中；

④培養板經培養96-120小時后，取細胞培養上清進行ELISA檢測。

4.如權利要求3所述的定量檢測法，其特征在于：所述細胞培養板是384孔培養板，接種的細胞密度控制在每孔1800-3000個細胞，體積為20-50μl；

所述培養階段③中，加入呼吸道合胞病毒RSV的量為：50-150倍TCID₅₀病毒稀釋液，體積為10-40μl。

5.如權利要求1所述的定量檢測法，其特征在于：所述A、B中的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測階段，步驟包括：

①在384孔酶標板內加入羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體，經孵育、洗滌后，加入封閉試劑作用，然后洗滌；

②在384孔酶標板內加入待測樣品經孵育、洗滌后，加入生物素結合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體，經孵育、洗滌；

③在384孔酶標板內加入抗生物素過氧化蛋白酶，經孵育、洗滌后，加入TMB顯色液作用后，再加入TMB終止液；

④在450nm波長處測量酶標板的吸光值。

6.如權利要求5所述的定量檢測法，其特征在于：所述ELISA檢測階段中，所涉及的所有洗滌是使用PBS-Tween?20洗滌3次以上；

所述ELISA檢測階段的步驟①中，羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體加入量為：羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的1∶480-1∶2000倍的稀釋液，每孔加入30-70μl，孵育的條件為：37℃孵育1-3小時；

封閉試劑為0.5％-2％的BSA，加入的量為每孔100-120μl，4℃過夜或者37℃孵育2-4小時。

7.如權利要求5所述的定量檢測法，其特征在于：所述ELISA檢測階段的步驟②中，待測樣品包括：細胞培養上清，臨床或臨床前樣品；

待測樣品的加入量為10-50μl，待測樣品孵育的條件為：25℃過夜或者37℃孵育1-3小時；

生物素結合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的加入量為：生物素結合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的1∶2000-1∶10000倍的稀釋液，每孔加入30-70μl，孵育的條件為：37℃孵育1-3小時。

8.如權利要求5所述的定量檢測法，其特征在于：所述ELISA檢測階段的步驟③中，抗生物素過氧化蛋白酶的加入量為：抗生物素過氧化蛋白酶的1∶1000-1∶4000倍的稀釋液，每孔加入30-70μl，孵育的條件為：37℃孵育20-40分鐘；

TMB的加入量為每孔30-60μl，常溫作用2-15分鐘；

TMB終止液的加入量為每孔30-60μl。

9.如權利要求1所述的一種應用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗的定量檢測試劑盒，其特征在于：所述定量檢測試劑盒包括：呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑。

10.如權利要求9所述的定量檢測試劑盒，其特征在于：所述定量檢測試劑盒，還包括：Hep2細胞、呼吸道合胞病毒RSV、384孔酶標板；

所述呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑包括：羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體、生物素結合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體、抗生物素過氧化蛋白酶、封閉試劑、洗滌液、TMB顯色液、TMB終止液。