[發明專利]促使骨髓間充質干細胞在大鼠腦內分化成神經元的新方法

無效

• 申請號: 201110310497.3
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN103045540A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 田杰
• 申請（專利權）人: 北京清美聯創干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/12;A61K35/28;A61K48/00;A61P25/00;A61P25/16;A61P25/28
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技術領域

本發明涉及一種通過病毒載體體外轉導神經營養因子編碼基因，促使腦內移植的骨髓間充質干細胞高效定向分化成神經元，同時旁分泌神經營養因子營養、支持周圍神經細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)起源于中胚層，是成纖維細胞、成骨細胞、脂肪細胞等多種基質細胞的前體細胞，具有較強的增殖能力和多分化潛能。MSCs可通過貼壁培養達到較高的純度。MSCs在體外可被誘導分化為表達NeuN的神經元和表達GFAP的神經膠質細胞。將MSCs移植到腦組織中，可長期存活，并向神經細胞分化。但實驗表明植入腦的MSCs大部分分化為神經膠質細胞，分化為神經元樣細胞的比例較小。過多的神經膠質細胞不但對改善神經功能無益，還可導致膠質疤痕形成等副作用。因此，如何提高腦內移植的MSCs向神經元分化，特別是能夠建立正確突觸聯系的神經元，是間充質干細胞治療退化性神經系統疾病的關鍵。

腦源性神經營養因子(brain-derived?neurotrophic?factor，BDNF)是神經營養因子(neurotrophin)家族成員之一，對神經細胞具有普遍的營養、支持作用，可促使神經干細胞增殖并向神經元分化。當將BDNF和骨髓細胞混合移植到大鼠大腦中動脈閉塞梗塞邊緣區時，BDNF可以促進腦內移植的MSCs增殖并向神經元分化。但是BDNF蛋白質在腦的半壽期很短，所以將BDNF與MSCs混合移植，并不能讓BDNF充分發揮其生物功能，因此必須尋找一種可以使BDNF長期作用于植入的MSCs的方法。

當代基因工程技術提供了各種載體，可將基因片段導入細胞中表達。其中逆轉錄病毒基因載體是較為廣泛應用的一種。該載體可將外源基因整合到靶細胞的基因組中，因此可使目的基因在靶細胞中長期、穩定表達。已有實驗表明逆轉錄病毒可將外源基因導入MSCs并穩定表達。

因此，利用逆轉錄病毒將BDNF基因導入MSCs，然后將攜帶重組BDNF基因的MSCs植入腦內，在BDNF的作用下，可使這種基因修飾后的MSCs的腦內存活率及神經元分化比率大大提高，同時大量旁分泌的BDNF，可以營養、支持腦出血后遺癥、帕金森癥、阿爾茨海默癥等病變組織及其周圍的神經細胞。因此本發明可為干細胞移植治療腦血管疾病、老年癡呆、腦外傷后遺癥、神經系統變性疾病等提供來源充足、取自自體的種子細胞，并使種子細胞更好地修復補充受損神經元，維持殘存神經元。另外，利用MSCs在體內的歸巢性，還可將載有目的基因的MSCs用于治療遺傳性神經病和神經系統其他疾病，同時為相關的藥物開發和篩選提供一種新的模式。

發明內容

本發明的目的是提供一種通過攜帶人BDNF編碼基因的逆轉錄病毒，將BDNF基因導入MSCs，經篩選獲得攜帶重組BDNF基因的MSCs(BDNF-MSCs)，將BDNF-MSCs植入腦，在自分泌的BDNF誘導下定向分化成神經元的方法。技術方案如下：

從人骨髓中分離得到hMSCs，再利用反復貼壁培養純化。從人的神經母細胞瘤細胞中克隆人BDNF的cDNA片段，構建重組質粒pMSCV-hBDNF，建立逆轉錄病毒細胞株。制備病毒并純化。以重組BDNF基因的逆轉錄病毒感染MSCs，通過耐藥基因篩選，使BDNF在MSCs內穩定表達。本發明能夠在通過高效轉導使外源性基因在MSCs中穩定表達的同時，保持MSCs在體內、體外的多能性和其他生物特性。

本發明的另一個主要內容是通過特定的細胞密度和注射方式，使BNDF-MSCs在腦內分化為神經元細胞，同時通過旁分泌BDNF營養、支持周圍神經細胞。通過DAPI核染色區分供體細胞和自體細胞，利用神經細胞特異表型蛋白可以證明BDNF-MSCs在腦內向神經元分化的比例為55％，而未經基因修飾的MSCs在腦內向神經元分化的比例為10％。

具體實施方式

實施例1、攜帶hBDNF編碼基因的逆轉錄病毒的制備

離心收集2～3X10⁶神經母細胞瘤(SK-N-SH)細胞，抽提總RNA，構建cDNA文庫，以SK-N-SH?cDNA為模板，PCR引物為：

5’-ATGACCATCCTTTTCCTTAC-3’，5’-CTATCTTCCCCTTTTAATGG-3’

克隆hBDNF的cDNA，并將其連接到T-載體上進行測序。得到的hBDNF的氨基酸序列如下：