[發(fā)明專利]胚胎干細(xì)胞體外分化中藥活性物質(zhì)藥效篩選模型的建立及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110310493.5
• 申請(qǐng)日: 2011-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN103045536A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077;C12N5/0793;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥效篩選模型的建立及應(yīng)用，主要是關(guān)于藥物誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞體外分化中藥活性成分藥效篩選模型的建立及應(yīng)用，可高效率地對(duì)中藥藥效進(jìn)行快速篩選與評(píng)估。

背景技術(shù)

經(jīng)典的藥效篩選模型包括(1)整體動(dòng)物水平的藥效篩選模型：其優(yōu)點(diǎn)是可以從整體水平，直觀反映藥物的治療作用；缺點(diǎn)是需要大量動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，需要大量供試品，不適用于藥效的初步大規(guī)模篩選；(2)組織器官(如離體心臟)水平的藥效篩選模型：主要缺點(diǎn)是不能反映神經(jīng)和體液對(duì)器官藥理效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，且其篩選規(guī)模小、效率低、樣品需求量較大。(3)細(xì)胞水平的藥效篩選模型：有較好的代表性，供試品用量少，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選。其局限性在于不能反映藥物對(duì)某一類型細(xì)胞在持續(xù)發(fā)育過程中的作用信息，可供藥效評(píng)價(jià)的指標(biāo)較少。(4)基因水平的藥效篩選模型，可以大規(guī)模、高通量、快速篩選藥物活性成分，評(píng)價(jià)藥效。但此模型尚不能體現(xiàn)藥物對(duì)生命體活動(dòng)的影響過程及藥物與大分子作用時(shí)重要生命過程變化的性質(zhì)(如基因調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯后修飾，信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)等)。

研究胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)體外定向分化成單一類型細(xì)胞(心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)起始于90年代，主要用于(1)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究；(2)再生醫(yī)學(xué)研究；(3)發(fā)育生物學(xué)研究。ES細(xì)胞具有體外不分化的永久增殖能力，當(dāng)處于合適的培養(yǎng)條件下，可定向分化形成某些單一類型細(xì)胞。國(guó)外在本世紀(jì)初即開始研究ES細(xì)胞的體外定向分化，已有ES細(xì)胞定向分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的報(bào)道，但ES細(xì)胞的分化成功率遠(yuǎn)低于藥物誘導(dǎo)的分化成功率。干細(xì)胞用于藥物篩選的工作在國(guó)外剛剛開始，國(guó)內(nèi)尚在起步階段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是利用ES細(xì)胞在特定條件下，可分化成單一類型細(xì)胞的性質(zhì)，在藥物誘導(dǎo)下，使ES細(xì)胞在體外分化成特定細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行藥物藥效初步篩選與評(píng)價(jià)。本發(fā)明主要分以下幾個(gè)步驟：

1.利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)；

2.藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)；

3.利用該模型進(jìn)行藥效篩選與評(píng)估。

本發(fā)明利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)，其特征是：選用小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞株)，接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

本發(fā)明進(jìn)行的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是：當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為單一類型細(xì)胞時(shí)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基將ES-D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，再懸滴培養(yǎng)成擬胚體，擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，加入供試藥物共同培養(yǎng)，當(dāng)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定標(biāo)志，則以此作為定向分化成功的指標(biāo)。對(duì)誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞時(shí)，擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定標(biāo)志是有節(jié)律地搏動(dòng)。根據(jù)藥物誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定指標(biāo)，及藥物誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以此作為藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)試藥物可以是黃芪、淫羊藿苷、葛根素、銀杏黃酮、丹參等中藥活性物質(zhì)。

本發(fā)明所用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清。

用本發(fā)明方法可構(gòu)建心肌細(xì)胞定向分化模型、神經(jīng)元定向分化模型、血管發(fā)生定向分化模型等多種單一類型細(xì)胞模型，用于相關(guān)藥物的藥效初步篩選與評(píng)價(jià)。

利用本發(fā)明方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，還可進(jìn)行心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究、心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究和離子通道形成研究。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.應(yīng)用面非常廣：ES細(xì)胞具有體外不分化的無(wú)限增殖能力，構(gòu)建藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化形成單一類型細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)的藥效篩選模型，可初步評(píng)價(jià)以心臟、神經(jīng)、血管等為作用靶點(diǎn)的多種新型藥物的藥效。藥物在誘導(dǎo)過程中，可能通過干預(yù)多個(gè)環(huán)節(jié)使ES細(xì)胞定向分化為某種單一類型細(xì)胞，因此在該模型的應(yīng)用中，只要藥物具有干預(yù)其中某個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的作用，就可初步評(píng)價(jià)藥物的藥效。

2.生物信息量大、特異性強(qiáng)：ES細(xì)胞體外定向分化體系由于能夠基本模擬乃至重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的發(fā)育及組織器官生成過程，具備能人工控制、干預(yù)的特點(diǎn)；并且可專一性地通過ES細(xì)胞在定向分化過程中，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等方面高度模擬藥物在整體動(dòng)物中的作用，重現(xiàn)藥物對(duì)生物大分子調(diào)控的生命現(xiàn)象本質(zhì)，為新藥研制提供了簡(jiǎn)單有效的體外藥效評(píng)價(jià)模型。

3.對(duì)有誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為某種單一類型細(xì)胞的創(chuàng)新藥物，該篩選模型由于可呈現(xiàn)分化的全過程，亦可提供藥物作用特異性靶點(diǎn)研究，并有可能發(fā)現(xiàn)一些有治療功能的基因。