[發明專利]從膨脹液中分離脂肪間充質干細胞的方法

無效

• 申請號: 201110310461.5
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102329773A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 鄭榆坤;海泉
• 申請（專利權）人: 成都清科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 徐宏;吳彥峰

技術領域

本發明涉及從膨脹液中分離脂肪間充質干細胞的方法，屬于生物醫藥領域。

背景技術

間充質干細胞【mesenchymal?stem?cells,MSC】是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。

目前，脂肪干細胞的分離主要是從抽取的脂肪組織來源，已有的專利申請目前都是從脂肪組織中提取，例如：一種脂肪干細胞的分離培養方法(申請號：CN201010568873.4，公開號：CN102002478A)；人脂肪成體干細胞的獲取方法及該干細胞庫的構建方法(申請號：CN201010120944.4，公開號：CN102002475A)；一種脂肪間充質干細胞的分離培養方法及其應用(申請號：CN200410084407.3，公開號：CN1778905)；從脂肪組織中分離間充質干細胞的方法(申請號：CN201010580537.1，公開號：CN101984049A)。還尚未有人報道從膨脹液中分離脂肪干細胞的專利。

膨脹吸脂是目前在外科吸脂手術中應用的最為廣泛一種技術，主要是在手術前灌注超量低滲膨脹液，該液具有止痛、止血、疏松及裂解脂肪細胞的作用。本發明人從臨床應用中發現，抽脂過程中獲得的膨脹液也含有一定量的脂肪干細胞。這為干細胞的獲取提供了新的來源，增添了新的脂肪干細胞來源途徑。

發明內容

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種從膨脹液中分離脂肪間充質干細胞的方法，由以下步驟組成：?（1）膨脹液的收集?????抽脂前向所要抽取部位灌注過量低滲膨脹液，然后將抽脂過程中獲取的脂肪與膨脹液混合液約500ml置于室溫下放置10min，待脂肪與膨脹液完全分離后，用移液槍吸取黃色脂肪下面部分的紅色液體，即為含有脂肪干細胞的膨脹液。，將其分裝入50ml離心管。?（2）膨脹液的處理??????將收集到的膨脹液放入離心機以1500rpm離心5min。離心吸取棄掉離心管上面部分的液體，收集沉淀。每管用PBS液懸浮，加入紅細胞裂解液室溫靜置5分鐘，以1200rpm離心3min，棄上清液。?（3）細胞的洗滌?????加入5ml?DMEM（不含血清）將沉淀吹散，細胞濾器過濾。過濾以后的液體以1200rpm離心3min，沉淀即為要獲取的脂肪間充質干細胞。再加入DMEM（不含血清）重復以上的操作洗滌3次。

（4）細胞培養

將獲取細胞接種至75cm²細胞培養瓶內，接種，加入間充質干細胞培養基。37℃，5%CO₂培養。

（5）細胞鑒定

對分離培養的細胞與脂肪來源干細胞進行形態學、免疫表型鑒定并進行比較。

（6）對膨脹液來源脂肪干細胞進行成脂、成骨和成軟骨三向分化潛能鑒定。

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進一步的，步驟1中所述的膨脹液是在1000ml生理鹽水中加入20ml利多卡因和1ml腎上腺素制備得到的。

進一步的，步驟2所述PBS液的加入量為3?ml，紅細胞裂解液加入的體積量為沉淀和PBS液總體積的1-2倍。

進一步的，步驟4中接種密度為5000個/cm²，間充質干細胞培養基的加入量為10?ml。

進一步的，步驟5中的免疫表型鑒定是指對CD73,?CD90,?CD105和CD45,CD34,?CD14,?CD11b,?CD19?,?HLA-DR進行檢測。

進一步的，步驟6中的分化潛能鑒定是對分離細胞進行成脂、成骨和成軟骨三向分化潛能測試。

本發明上述方案中采用的材料和試劑如下：

膨脹液：利多卡因?20ML/L??腎上腺素?1ML/L；

紅細胞裂解液?Solarbio，北京；

DMEM（不含血清）?HyClone，美國；

間充質干細胞培養基?stemcell?美國；

抗體?BD，美國；

離心管?Coring，美國；

移液管?Coring，美國；

細胞濾網?BD，美國；

移液槍?BRAND，德國；

離心機?湘麓，湖南；

培養瓶?Coring，美國；