[發明專利]從膨脹液中分離脂肪間充質干細胞的方法

無效

• 申請號: 201110310461.5
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102329773A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 鄭榆坤;海泉
• 申請（專利權）人: 成都清科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 徐宏;吳彥峰

1.一種從膨脹液中分離脂肪間充質干細胞的方法，由以下步驟組成：

（1）膨脹液的收集?????抽脂前向所要抽取部位灌注過量低滲膨脹液，然后將抽脂過程中獲取的脂肪與膨脹液置于室溫下放置10min，待脂肪與膨脹液完全分離后，用移液槍吸取黃色脂肪下面部分的紅色液體，即為含有脂肪干細胞的膨脹液。

2.?（2）膨脹液的處理?????將收集到的膨脹液分裝入50ml離心管，放入離心機以1500rpm離心5min。

3.離心吸取棄掉離心管上面部分的液體，收集沉淀，每管用PBS液懸浮，加入紅細胞裂解液室溫靜置5分鐘，以1200rpm離心3min，棄上清液；?（3）細胞的洗滌?????加入5ml?DMEM（不含血清）將沉淀吹散，細胞濾器過濾，過濾以后的液體以1200rpm離心3min，沉淀即為要獲取的脂肪間充質干細胞，再加入DMEM（不含血清）重復以上的操作洗滌3次；

（4）細胞培養

將獲取細胞接種至75cm²細胞培養瓶內，接種，加入間充質干細胞培養基，37℃，5%CO₂培養；

（5）細胞鑒定

對分離培養的細胞與脂肪來源干細胞進行形態學、免疫表型鑒定并進行比較。

4.（6）對膨脹液來源脂肪干細胞進行成脂、成骨和成軟骨三向分化潛能鑒定。

5.如權利要求1所述的方法，其中步驟1所述的膨脹液是在1000ml生理鹽水中加入20ml利多卡因和1ml腎上腺素制備得到的。

6.如權利要求1所述的方法，其中步驟2所述?PBS液的加入量為3?ml，紅細胞裂解液加入的體積量為沉淀和PBS液總體積的1-2倍。

7.如權利要求1-3任一項所述的方法，其中步驟4所述的接種密度為5000個/cm²，間充質干細胞培養基的加入量為10?ml。

8.如權利要求1-4任一項所述的方法，其中步驟5所述的免疫表型鑒定是指對CD73,?CD90,?CD105和CD45,CD34,?CD14,?CD11b,?CD19?,?HLA-DR進行檢測。

9.如權利要求1-5任一項所述的方法，其中步驟6所述分化潛能鑒定是對分離細胞進行成脂、成骨和成軟骨三向誘導分化，染色觀察分化效果。