[發明專利]雞馬立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201110307837.7
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102363769A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 劉長軍;張艷萍;李志杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/01;C12N15/09;C12N15/63;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

1.一種構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于： 所述的Meq基因缺失疫苗株是在親本毒株MDV?MS株的基礎上經兩次同源重組 得到的，第一次同源重組是在親本毒株MDV?MS株的基礎上通過插入報告基因 lacZ并同時替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分的468bp的堿基序列得到中 間體病毒株；后經第二次同源重組去掉中間體病毒株中插入的報告基因，即得 所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿基序列 如SEQ?ID?NO.1所示。

2.如權利要求1所述的構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法， 其特征在于：具體的包括以下步驟：

(1)轉移載體的構建

參照已發表的MDV強毒GA株相關基因序列，GeneBank登錄號為 No.AF147806，針對Meq基因兩側的片段A、B分別設計了引物對Primer?A和 Primer?B，片段A、B作為構建轉移載體質粒的同源序列；

所述的引物對Primer?A和Primer?B序列如下所示：

Primer?A??上游引物：5‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT?3’

??????????下游引物：5‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT?3’

Primer?B??上游引物：5‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC?3’

??????????下游引物：5‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT?3’

以MDV?MS株基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得Meq基因片段A， 經SalI和Sph?I酶切，與pUC19連接，得到質粒pUCA；PCR擴增得到Meq 基因片段B，經Sal?I和Sac?I酶切后，連接到pUCA中，得到質粒pUCAB；經 SalI酶切得到的LacZ表達基因盒，連接到pUCAB質粒中，得到質粒pALacZB；

(2)第一次同源重組：MDV?MS株基因組總DNA與轉移載體質粒pALacZB 共轉染雞胚成纖維細胞，在親本毒株MS株的基礎上通過插入報告基因lacZ并 同時替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的堿基序列得到雞馬立克氏 病病毒Meq基因缺失中間體病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿 基序列如SEQ?ID?NO.1所示；

(3)第二次同源重組：采用經第一次同源重組得到的雞馬立克氏病病毒 Meq基因缺失中間體病毒株的基因組總DNA與轉移載體質粒pUCAB共轉染雞 胚成纖維細胞，篩選得到去掉中間體病毒株中插入的報告基因的Meq基因缺失 疫苗株，即得所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。

3.由權利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺 失疫苗株。

4.如權利要求3所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株，其特征在 于所述的Meq基因缺失疫苗株為rMSΔMeq，保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，其微生物保藏編號是：CGMCC?No.4612。

5.如權利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備防治雞馬立克氏病 藥物中的用途。

6.如權利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備以其為活病毒載體 構建表達其他外源蛋白的重組病毒中的用途。

7.由權利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺 失中間體病毒株。

8.如權利要求7所述的Meq基因缺失中間體病毒株在制備以其為活病毒載 體構建表達其他外源蛋白的重組病毒中的用途。

9.一種疫苗組合物，其特征在于由有效量的權利要求3或4所述的基因缺 失疫苗株及藥學上接受的載體或佐劑組成。

10.一種用于區分權利要求3或5所述的基因缺失疫苗株和馬立克氏病毒 野毒株的方法，其特征在于以SEQ?ID?NO.1所示的序列作為模板序列，通過設 計引物進行PCR擴增檢測，優選的所述引物對序列如下所示：

5‘GGGAAATGACAGGTGAATTGTG?3’

5‘GCAGGAAAATTTGTTACCCCAG?3’。