[發(fā)明專(zhuān)利]雞馬立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其構(gòu)建方法及應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201110307837.7 | 申請(qǐng)日： | 2011-10-12 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN102363769A | 公開(kāi)（公告）日： | 2012-02-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 劉長(zhǎng)軍;張艷萍;李志杰 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N7/00 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N7/00;C12N7/01;C12N15/09;C12N15/63;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139 | 代理人： | 孫皓晨;韓小雷 |
| 地址： | 150001 黑龍*** | 國(guó)省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 雞馬立克氏 病毒 meq 基因 缺失 疫苗 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種構(gòu)建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于： 所述的Meq基因缺失疫苗株是在親本毒株MDV?MS株的基礎(chǔ)上經(jīng)兩次同源重組 得到的，第一次同源重組是在親本毒株MDV?MS株的基礎(chǔ)上通過(guò)插入報(bào)告基因 lacZ并同時(shí)替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分的468bp的堿基序列得到中 間體病毒株；后經(jīng)第二次同源重組去掉中間體病毒株中插入的報(bào)告基因，即得 所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿基序列 如SEQ?ID?NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法， 其特征在于：具體的包括以下步驟：
(1)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
參照已發(fā)表的MDV強(qiáng)毒GA株相關(guān)基因序列，GeneBank登錄號(hào)為 No.AF147806，針對(duì)Meq基因兩側(cè)的片段A、B分別設(shè)計(jì)了引物對(duì)Primer?A和 Primer?B，片段A、B作為構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的同源序列；
所述的引物對(duì)Primer?A和Primer?B序列如下所示：
Primer?A??上游引物：5‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT?3’
??????????下游引物：5‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT?3’
Primer?B??上游引物：5‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC?3’
??????????下游引物：5‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT?3’
以MDV?MS株基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法獲得Meq基因片段A， 經(jīng)SalI和Sph?I酶切，與pUC19連接，得到質(zhì)粒pUCA；PCR擴(kuò)增得到Meq 基因片段B，經(jīng)Sal?I和Sac?I酶切后，連接到pUCA中，得到質(zhì)粒pUCAB；經(jīng) SalI酶切得到的LacZ表達(dá)基因盒，連接到pUCAB質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pALacZB；
(2)第一次同源重組：MDV?MS株基因組總DNA與轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pALacZB 共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，在親本毒株MS株的基礎(chǔ)上通過(guò)插入報(bào)告基因lacZ并 同時(shí)替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的堿基序列得到雞馬立克氏 病病毒Meq基因缺失中間體病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿 基序列如SEQ?ID?NO.1所示；
(3)第二次同源重組：采用經(jīng)第一次同源重組得到的雞馬立克氏病病毒 Meq基因缺失中間體病毒株的基因組總DNA與轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUCAB共轉(zhuǎn)染雞 胚成纖維細(xì)胞，篩選得到去掉中間體病毒株中插入的報(bào)告基因的Meq基因缺失 疫苗株，即得所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。
3.由權(quán)利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺 失疫苗株。
4.如權(quán)利要求3所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株，其特征在 于所述的Meq基因缺失疫苗株為rMSΔMeq，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，其微生物保藏編號(hào)是：CGMCC?No.4612。
5.如權(quán)利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備防治雞馬立克氏病 藥物中的用途。
6.如權(quán)利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備以其為活病毒載體 構(gòu)建表達(dá)其他外源蛋白的重組病毒中的用途。
7.由權(quán)利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺 失中間體病毒株。
8.如權(quán)利要求7所述的Meq基因缺失中間體病毒株在制備以其為活病毒載 體構(gòu)建表達(dá)其他外源蛋白的重組病毒中的用途。
9.一種疫苗組合物，其特征在于由有效量的權(quán)利要求3或4所述的基因缺 失疫苗株及藥學(xué)上接受的載體或佐劑組成。
10.一種用于區(qū)分權(quán)利要求3或5所述的基因缺失疫苗株和馬立克氏病毒 野毒株的方法，其特征在于以SEQ?ID?NO.1所示的序列作為模板序列，通過(guò)設(shè) 計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，優(yōu)選的所述引物對(duì)序列如下所示：
5‘GGGAAATGACAGGTGAATTGTG?3’
5‘GCAGGAAAATTTGTTACCCCAG?3’。
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