[發明專利]雞馬立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201110307837.7
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102363769A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 劉長軍;張艷萍;李志杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/01;C12N15/09;C12N15/63;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

技術領域

本發明涉及一種由于基因缺失得到的弱毒疫苗株，尤其涉及雞馬立克氏病 病毒Meq基因缺失疫苗株，還涉及其在制備防治雞馬立克氏病藥物中的應用， 屬于生物醫藥領域。

背景技術

雞馬立克氏病(MD，Marek’s?Disease)是由感染馬立克病毒(MDV，Marek’s? Disease?virus)引起的，是一種嚴重危害養禽業發展的高度傳染性、腫瘤性疾病。 該病可引起雞發生多發性淋巴瘤，導致雞只衰竭、死亡。同時損傷雞體的免疫 器官，產生嚴重的免疫抑制，易并發其他疾病。該病病程較長，并且發生該病 后常導致整個雞群的淘汰，一旦發生該病，損失往往特別巨大。疫苗是控制該 病的主要手段，在種雞群、蛋雞群中MD疫苗是必須使用的疫苗，肉雞群中使 用該疫苗可以較大幅度地提高養殖效率。MD的病原-馬立克氏病毒(MDV)毒 力呈不斷演化的趨勢。近些年，隨著MDV更強毒力毒株的出現，尤其是特超強 毒的出現，現有的疫苗毒株，包括廣泛應用的HVT、CVI988疫苗株不能對其進 行良好的保護。在我國不同地區的養雞場中，MD疫苗免疫雞群常有MD的發 生。最近的報道表明，即使應用最新型的MDV疫苗，一些MDV強毒株也能引 起免疫雞群發生接近50％的MD死亡率。

我們研究組最近幾年連續從現地MD免疫失敗的養雞場分離到20多株 MDV強毒株，對其中部分毒株的免疫攻毒試驗表明，有些毒株可以突破HVT 疫苗、HVT+SB1雙價疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保護，證明我國 流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高，現有的所有MD疫苗均不能提供有效保 護。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。

MDV缺失某一基因后致腫瘤性喪失，而它的復制能力沒有被破壞，以這種 病毒研制的MD疫苗，它的免疫保護能力將非常高。近幾年MDV功能基因的研 究進展很快，Jarosinski等缺失MDV?RB1B株細菌人工染色體(BAC)的RLORF4 基因，發現缺失后的RBIB株在體內外的毒力減弱；Silva等將Md5株的2拷貝 132bp重復序列缺失，與親本病毒以相同方式接種SPF雞，也無毒力減弱趨勢。 Reddy課題組為了研究Meq基因功能，將Md5株的Meq基因去除，構建了一株 Meq基因缺失株rMd5ΔMeq。缺失株在體外生長穩定，同時也證明了Meq基因 在淋巴細胞感染期是非必需的。其免疫保護效果強于現用商業化疫苗株CVI988， 無論是實驗室人工攻毒試驗還是模擬田間試驗，都能誘發高水平的免疫反應，能 夠抵抗Md5(vv)和648A(vv+)的攻擊。針對不同增殖能力的野毒株缺失Meq 基因有很高的研究價值。

目前重組MDV的構建多采用BAC技術-是將BAC載體插入至病毒基因組 非必需位點，構建病毒感染性克隆。該方法也存在一些缺點，一是在病毒基因 組中插入了外源基因(BAC成分)，存在潛在的不利因素。二是病毒基因組在 操作過程中，需要在原核細胞中增殖和擴增。由于MDV病毒基因組很大，在原 核系統中增殖更易導致基因突變。

本研究是在分析近年來本實驗室從現地分離到的多株MDV流行毒株的生 物學特性的基礎上，選擇MDV?MS株為親本毒株，采用基因工程手段，通過兩 次同源重組的方法獲得了重組病毒株-rMSΔMeq。該構建重組病毒的方法避免 了采用BAC技術帶來的一些不利影響。該毒株對雞具有良好的安全性；以該毒 株免疫接種雞，可以提供高效的抗MDV免疫保護作用。該疫苗株的另外一個重 要特點是帶有基因缺失的遺傳標記，可以據此區分疫苗毒株和野生毒株，有利 于雞群的MDV感染檢測和免疫監控。同時，該基因缺失疫苗株也具有制備以其 為活病毒載體構建表達其他外源蛋白的重組病毒的用途。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有弱毒疫苗的不足，提供一種可以有 效預防雞馬立克氏病，并具有分子標記，利于免疫雞群的野毒感染和免疫監控 的新的雞馬立克氏病基因缺失疫苗株。用該疫苗株所制備的疫苗對目前我國流 行的雞馬立克氏病病毒可以提供良好的免疫保護效果。