[發明專利]一種豬TLR4基因T611A堿基突變的檢測方法

無效

• 申請號: 201110307720.9
• 申請日: 2011-10-10
• 公開（公告）號: CN102399868A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 方曉敏;劉筱;任守文;孟翠;李碧俠;王學敏
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

(一)技術領域

本發明涉及一種豬TLR4基因T611A堿基突變的檢測方法，屬基因工程技術領域。用此方法，能快速檢測到豬TLR4基因的單核苷酸堿基突變，為豬免疫防御系統受體基因分子結構、功能研究提供幫助。

(二)背景技術

Toll樣受體(TLRs)作為重要的模式識別受體，通過對病原體相關分子模式(PAMPs)的識別及信號級聯反應，介導機體的天然免疫和獲得性免疫，是機體抵抗感染的第一道屏障；TLRs基因變異導致宿主對革蘭陽性菌、陰性菌的反應能力喪失，改變機體對病原的抗性或易感性。

TLR4在病原微生物跨膜信號傳導具重要作用，研究已證實TLR4是機體對LPS免疫應答的主要受體，敲除該基因的小鼠對細菌性病原的刺激應答明顯減弱，TLR4基因缺陷小鼠對病毒的抵抗能力降低。

目前有關豬TLR4基因的SNP檢測偶見報道，但基本局限在個別外顯子的單個堿基突變。本發明根據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計引物，對中外不同品種豬TLR4基因整個編碼區進行特異性PCR擴增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并分析堿基突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為豬Toll樣受體與機體免疫力的關系研究奠定基礎，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。

(三)發明內容

技術問題

本發明的目的在于提供一種豬TLR4基因T611A堿基突變的檢測方法，有助于研究豬TLR4基因的分子結構、功能及機體抗病原免疫模式和機理，為豬疫病防控及抗病育種提供依據。

技術方案

一種豬TLR4基因T611A堿基突變的檢測方法，包括：

設計豬TLR4基因序列特異性擴增引物，對豬模板cDNA進行PCR擴增；分離、純化特異性擴增產物進行核酸序列測定、比對，找尋不同檢測個體TLR4基因存在的單核苷酸堿基突變，分析基因突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、功能的改變。其特征在于如下步驟：

步驟一，據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計特異引物：

正義引物5′-TTTCTAACCTGCCCAACCTG-3′

反義引物5′-GAACCAGCCAGACCTTGAAT-3′

應用上述對待檢測豬模板cDNA進行PCR擴增。

PCR擴增反應體系(12μl)：10×PCR?buffer?1.2μl，2mM/L?dNTPs?1.2μl，25mM/L?MgCl₂0.8μl，10pmol/μl?primer?1.0μl，5U/μl?Taq?polymerase?0.2μl，50ng/μl?DNA?0.8μl，ddH₂O?6.8μl；

反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，34個循環；72℃延伸8min；

其中，擴增片段長度為247bp。

步驟二，對特異性擴增產物進行分離、純化，獲得特異核酸；

步驟三，對分離純化的擴增產物進行序列測定、比對分析，得出待檢豬TLR4基因是否存在T611A單核苷酸堿基突變。

有益效果

本發明根據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計引物，對中外不同品種豬TLR4基因整個編碼區進行特異性PCR擴增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并為豬Toll樣受體與機體免疫力的關系研究奠定基礎，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。

本發明通過研究，確定了檢測豬TLR4基因編碼區T611A堿基突變合適的特異引物SEQ?ID?NO：1-2，優化的PCR擴增程序和條件，明確了豬TLR4基因有效的單核苷酸突變堿基及相應的編碼氨基酸改變，分析堿基突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為TLR4受體基因遺傳變異導致分子結構及功能變化提供理論依據，同時，為TLR4作為免疫模式受體基因發生變異而引起機體對部分傳染性疾病免疫能力的改變等研究提供技術支持。

(四)附圖說明

圖1：PCR擴增產物PAGE電泳示例

圖2：突變點測序結果示例

(五)具體實施方式

本發明針對豬TLR4基因編碼區的篩查，檢測到豬該基因存在T611A單核苷酸堿基突變，引起Leu204His編碼氨基酸的改變。

針于豬TLR4基因堿基突變的檢測技術較多，包括DNA直接測序、雜交測序、酶切測序、DNA芯片技術、變性高效液相色譜等。較常規簡易的實施方式為：