[發(fā)明專利]檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針、實(shí)時熒光定量PCR方法及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110307502.5
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN102312013A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王長軍;朱靜;張錦海;胡丹;潘秀珍;唐家琦
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 何朝旭

1.一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針，其特征是，包括由引物對SalK-F和SalK-R、及探針SalK-probe組成的SalK引物探針序列集；其中，引物SalK-F的序列如SEQ?ID?No.1所示，引物SalK-R的序列如SEQ?ID?No.2所示，探針SalK-probe的序列如SEQ?ID?No.3所示；所述探針SalK-probe的5′端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3′端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針，其特征是，還包括由引物對virB4-89K-F和virB4-89K-R、及探針virB4-89K-probe組成的virB4-89K引物探針序列集，和/或由引物對cps2J-F和cps2J-R、及探針cps2J-probe組成的cps2J引物探針序列集；其中，引物virB4-89K-F的序列如SEQ?ID?No.4所示，引物virB4-89K-R的序列如SEQ?ID?No.5所示，探針virB4-89K-probe的序列如SEQ?ID?No.6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ?ID?No.7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ?ID?No.8所示，探針cps2J-probe的序列如SEQ?ID?No.9所示；所述探針virB4-89K-probe、探針cps2J-probe的5′端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3′端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。

3.一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)選擇引物探針序列集：選擇由SEQ?ID?No.1-3組成的SalK引物探針序列集；其中，探針SalK-probe的5′端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3′端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一；

(2)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)：以待測樣品的基因組DNA為擴(kuò)增模板，根據(jù)所選引物探針序列集的探針上所標(biāo)記的報告熒光基團(tuán)選擇熒光通道，利用所選引物探針序列集的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，同時記錄熒光曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)CT；

其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因SalK的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)CT≤35、且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，所述步驟(1)中還選擇由SEQ?ID?No.4-6組成的virB4-89K引物探針序列集，和/或由SEQ?ID?No.7-9組成的cps2J引物探針序列集；其中探針virB4-89K-probe、探針cps2J-probe的5′端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3′端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；

其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因virB4-89K、所述2型豬鏈球菌的基因cps2J的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為：當(dāng)CT≤35、且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?/p>

第一階段：初期變性，93℃-95℃30秒-120秒；

第二階段：PCR反應(yīng)，93℃-95℃變性5-15秒，60℃退火并延伸28-40秒，同時監(jiān)測熒光曲線；重復(fù)30-50個循環(huán)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的體系由以下組分構(gòu)成：體系終濃度為1.25U/20μl的Premix?Ex?Taq聚合酶，體系終濃度為5mmol/L的鎂離子，體系終濃度為0.2μmol/L的各引物，體系終濃度為0.5μmol/L的各探針，體系終濃度為0.2μmol/L的ROX?Reference?Dye?II，待測樣品基因組DNA溶液4μl，雙蒸水適量；整個體系的總體積為20μl。