[發明專利]長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養基

無效

• 申請號: 201110306604.5
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102329771A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 王丙云;陳勝鋒;陳志勝;計慧琴
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 佛山市永裕信專利代理有限公司 44206
• 代理人: 楊啟成

技術領域

本發明涉及一種動物細胞工程領域，特別市一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養基。

背景技術

胚胎干細胞是從動物早期胚胎的內細胞團或原始生殖細胞分離出來的一種具有發育全能性的高度未分化細胞，可分化形成動物機體的絕大多數終端細胞以及具有生殖系傳遞能力，因此在組織器官工程、細胞治療以及動物遺傳修飾與操作等方面具有廣闊的應用前景。

胚胎干細胞具有自發分化的趨勢，培養胚胎干細胞的關鍵技術是需要篩選合適的培養體系使細胞既能快速無限增殖又能保持未分化狀態。常用方法包括：（1）采用飼養層，飼養層細胞通過某種尚不完全清楚的機理抑制胚胎干細胞的分化；（2）條件培養基：條件培養基中含有抑制細胞分子的因子；（3）采用抑制細胞分化或促進細胞增殖的細胞因子，包括白血病抑制因子，干細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子等等。自1981年Evans?等從延遲著床的小鼠早期胚胎成功建立胚胎干細胞系以來，基于上述一種或多種方法的聯合運用，目前已在人、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、馬以及兔等物種實現了胚胎干細胞的長期傳代培養并成功建立胚胎干細胞系或類胚胎干細胞系。但迄今為止，盡管有培養雞胚胎干細胞的報道，但均只能在很短的時間內維持其未分化狀態，尚未能實現雞胚胎干細胞在體外的長期傳代培養及建立細胞系。雞胚胎干細胞不能在體外長期傳代培養的一個重要原因是，目前的胚胎干細胞培養體系，包括培養基配方，均是基于鼠或人等哺乳動物而設計，而禽類細胞與哺乳動物細胞存在較大差異，一些適用于哺乳動物胚胎干細胞的培養條件或培養基配方，可能并不能完全滿足雞胚胎干細胞離體培養的需要。因此，這些培養條件或培養基配方，盡管能夠在一段時間內使雞胚胎干細胞維持未分化狀態，但長期傳代培養時將不能維持這種狀態而導致細胞迅速分化。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種適用于雞胚胎干細胞的培養體系，以實現雞胚胎干細胞在體外的長期傳代培養的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養基。

????本發明的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法是這樣實現的，分離????????????????????????????????????????????????期胚盤明區的細胞，經機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養層，用上述雞胚胎干細胞在專用培養基及37~38℃環境下培養，3~5天傳代一次，專用培養基包括條件培養液600—900mL；胎牛血清50—150?mL；雞血清5—20?mL；非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5—25?mL；L-谷氨酰胺0.146—0.292?g；β-巰基乙醇6—14?μL；小鼠白血病抑制因子1—2×10^6?IU；堿性成纖維細胞生長因子10—50?μg；干細胞生長因子5—20?μg，將上述成分用DMEM高糖培養基定容至1000?mL，調pH值為7.2—7.5，條件培養液是這樣獲得的，培養BRL-3A細胞至細胞匯合后（通常為3天），收集培養細胞的上清液，離心分離后再經濾膜過濾所得即為條件培養液。這里，濾膜是0.22um微孔得濾膜，離心分離的轉速為1000rpm，離心分離時間不少于5min。

????本發明的專用培養基包括條件培養液600—900mL；胎牛血清50—150?mL；雞血清5—20?mL；非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5—25?mL；L-谷氨酰胺0.146—0.292?g；β-巰基乙醇6—14?μL；小鼠白血病抑制因子1—2×10^6?IU；堿性成纖維細胞生長因子10—50?μg；干細胞生長因子5—20?μg，將上述成分用DMEM高糖培養基定容至1000?mL，調pH值為7.2—7.5，條件培養液是這樣獲得的，培養BRL-3A細胞至細胞匯合后（通常為3天），收集培養細胞的上清液，離心分離后再經濾膜過濾所得即為條件培養液。這里，濾膜是0.22um微孔得濾膜，離心分離的轉速為1000rpm，離心分離時間不少于5min。

????本發明與已有技術相比，具有可以實現雞胚胎干細胞的長期傳代培養，并具有細胞增殖快、克隆獲得率高的優點。

附圖說明

圖1（A）為在本發明所述培養體系中培養的傳至第2代的雞胚胎干細胞；

圖1（B）為在本發明所述培養體系中培養的傳至第5代的雞胚胎干細胞；