[發明專利]長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養基

無效

• 申請號: 201110306604.5
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102329771A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 王丙云;陳勝鋒;陳志勝;計慧琴
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 佛山市永裕信專利代理有限公司 44206
• 代理人: 楊啟成

1.長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法，其特征在于分離????????????????????????????????????????????????期胚盤明區的細胞，經機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養層，用上述雞胚胎干細胞在專用培養基及37~38℃環境下培養，3~5天傳代一次，專用培養基包括條件培養液600—900mL；胎牛血清50—150?mL；雞血清5—20?mL；非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5—25?mL；L-谷氨酰胺0.146—0.292?g；β-巰基乙醇6—14?μL；小鼠白血病抑制因子1—2×10^6?IU；堿性成纖維細胞生長因子10—50?μg；干細胞生長因子5—20?μg，將上述成分用DMEM高糖培養基定容至1000?mL，調pH值為7.2—7.5，條件培養液是這樣獲得的，培養BRL-3A細胞至細胞匯合后，收集培養細胞的上清液，離心分離后再經濾膜過濾所得即為條件培養液。

2.根據權利要求1所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法，其特征在于分離期胚盤明區的細胞，經機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養層是這樣實現的，包括

（1）小鼠胚胎成纖維細胞、雞胚成纖維細胞以及STO細胞株按常規方法培養于含體積百分比為10%的胎牛血清、體積百分比衛1%的雙抗的高糖DMEM培養液；

（2）80%-90%細胞匯合時，棄培養液，PBS洗2—3次；

（3）加入終濃度為10μg/mL的絲裂霉素-C，37℃孵育2—2.5?h；

（4）棄絲裂霉素-C，PBS?充分洗滌細胞6—7次，確保完全去除絲裂霉素-C；

（5）加適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化30s左右，加DMEM液終止消化，充分吹打，制備單細胞懸液；

（6）1000?rpm離心5—8?min，用含體積百分比為10%胎牛血清、體積百分比為1%的雙抗的高糖DMEM培養液重懸細胞，調整細胞密度為5×10⁵個/mL，接種于經?0.1%明膠包被的培養板，置37℃，5%CO₂，培養箱中培養；

(7)?24?h后觀察細胞生長情況，若細胞未能鋪滿單層則補加絲裂霉素C處理過的細胞，以確保細胞能連成一片而沒有間隙。

3.?根據權利要求1或2所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法，其特征在于培養BRL-3A細胞是將BRL-3A細胞接種于培養瓶，用BRL-3A細胞培養液培養。

4.?根據權利要求3所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法，其特征在于培養BRL-3A細胞時待細胞80%-90%匯合時，棄培養液，每55cm²生長面積的細胞加入10?mL新鮮BRL-3A細胞培養液。

5.?根據權利要求4所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的方法，其特征在于加入新鮮BRL-3A細胞培養液?3天后收集BRL-3A細胞培養液—即上清液，置無菌瓶，-20℃凍存，使用前離心分離并經過0.22μm微孔濾膜過濾除菌，然后調整pH值至7.2。

6.?長期傳代培養雞胚胎干細胞的專用培養基，其特征在于包括條件培養液600—900mL；胎牛血清50—150?mL；雞血清5—20?mL；非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5—25?mL；L-谷氨酰胺0.146—0.292?g；β-巰基乙醇6—14?μL；小鼠白血病抑制因子1—2×10^6?IU；堿性成纖維細胞生長因子10—50?μg；干細胞生長因子5—20?μg，將上述成分用DMEM高糖培養基定容至1000?mL，調pH值為7.2—7.5，條件培養液是這樣獲得的，培養BRL-3A細胞至細胞匯合后，收集培養細胞的上清液，離心分離后再經濾膜過濾所得即為條件培養液。

7.?根據權利要求6所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的專用培養基，其特征在于培養BRL-3A細胞時待細胞80%-90%匯合時，棄培養液，每55cm²生長面積的細胞加入10?mL新鮮BRL-3A細胞培養液。

8.?根據權利要求7所述的長期傳代培養雞胚胎干細胞的專用培養基，其特征在于加入新鮮BRL-3A細胞培養液?3天后收集BRL-3A細胞培養液—即上清液，置無菌瓶，-20℃凍存，使用前離心分離并經過0.22μm微孔濾膜過濾除菌，然后調整pH值至7.2。