[發(fā)明專利]白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110306047.7
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN102312012A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉新銳;謝寶貴;吳小平;江玉姬;徐美玲;鄧優(yōu)錦;朱堅(jiān)
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及食用菌雜種的鑒定方法，具體涉及白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法。

背景技術(shù)

????白靈菇是白靈側(cè)耳的商品名稱，又名翅鮑菇、白靈芝菇、克什米爾神菇等，其分布與新疆阿魏（Ferula?sinkiangensin?K.M.Shen）的分布密切相關(guān)，僅分布在我國新疆的阿爾泰、托里、木壘、塔城等地有新疆阿魏生長的荒灘，分布海拔高度在720—1000m，其基因資源有限。杏鮑菇?(Pleurotus?eryngii?(DC.:Fr.)?Quél)發(fā)生于傘形花科刺芹屬，刺芹枯死的植株上，在我國新疆、青海、四川西部有自然分布，基因資源較白靈菇豐富。

白靈菇和杏鮑菇不僅有很高的營養(yǎng)價(jià)值，口感風(fēng)味好，而且還有很高的藥用價(jià)值，市場前景廣闊。但白靈菇的組織致密性、口感、朵形顏色優(yōu)于杏鮑菇，而風(fēng)味、生長周期、生物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)管理?xiàng)l件劣于杏鮑菇，因此，可以應(yīng)用生物技術(shù)將兩者的基因融合在一起，從而獲得具有白靈菇與杏鮑菇特性的雜交種，篩選出優(yōu)良的雜交種，增加市場上白靈菇的品種，促進(jìn)白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

為了快速篩選白靈菇與杏鮑菇的雜交種，有必要探索鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真?zhèn)巍?/p>

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，為有效鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真?zhèn)翁峁┍憬莸姆椒ǎM(jìn)而在白靈菇與杏鮑菇的雜種中篩選出優(yōu)良的雜交種，從而縮短白靈菇的育種進(jìn)程。?????。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測；其特征在于：

1、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生：在8～12?μL?ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,?加入2μL?EcoO109I酶的酶切Buffer，0.8～1.2?μL?EcoO109I酶,?5～?9.8μL?ddH₂O，37℃水浴4～7?h；所述EcoO109I酶的酶切Buffer成份為100mmol/L??Tris-HCl,??pH7.5，100mmol/L??MgCl₂，10?mmol/L??Dithiothreitol；

2、酶切產(chǎn)物的電泳檢測：取EcoO109I酶的酶切產(chǎn)物15μL，與3μL上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上，于0.5?X?TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經(jīng)電泳檢測，在一個(gè)泳道上只有同時(shí)出現(xiàn)分子量為675～685bp、435～445?bp和235～245bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記；所述上樣緩沖液：0.1％?溴酚藍(lán),?40%?蔗糖。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，具有檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

1、檢測時(shí)間短：該檢測所需時(shí)間短，一般只需要10～15天，比通過出菇獲得子實(shí)體形態(tài)鑒定至少省40天以上。

2、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好：本發(fā)明以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，是區(qū)分物種的本質(zhì)表現(xiàn)所在，而DNA序列中的保守序列更是穩(wěn)定，是物種長期進(jìn)化的分子標(biāo)記，不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開發(fā)的鑒定技術(shù)準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好。

3、專一性強(qiáng)：本發(fā)明充分利用酶的專一性和高效性，且本發(fā)明使用的酶對白靈菇和杏鮑菇的雜種具有特異性，產(chǎn)生特異識別性的標(biāo)記片段，非此雜種得不到這種效果。

4、容易判斷：本發(fā)明的判斷依據(jù)是在瓊脂糖電泳上出現(xiàn)的特異DNA標(biāo)記條帶，DNA標(biāo)記條帶少、清晰，一目了然。?????????

附圖說明

圖1為EcoO109I酶的酶切電泳圖；其中，M～3為泳道編號；左側(cè)的數(shù)字和右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量。圖1中，1～3泳道分子量為678bp，440?bp和237?bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。

一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟：

1、白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合：

選取優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的白靈菇菌株和杏鮑菇菌株作為雜交親本；