[發明專利]直接從人成纖維細胞誘導產生多巴胺樣神經元的方法及應用

無效

• 申請號: 201110304493.4
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN103031335A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 李川源;劉新建;李芳;黃倩
• 申請（專利權）人: 李川源;黃倩
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N5/10
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及誘導產生多巴胺樣神經元的方法，尤其涉及直接將人的成纖維細胞轉變成能產生神經遞質多巴胺的神經元樣細胞的方法及其用途。

背景技術

現有技術公開了神經遞質多巴胺在維持人的正常運動和動作協調方面起重要作用，當產生多巴胺的神經元發生凋亡時，多巴胺的產生減少，患者將出現肌肉震顫，動作不協調甚至運動障礙，醫學上稱為帕金森氏病。目前還沒有有效的藥物能治療帕金森氏病。有人嘗試移植能產生多巴胺的神經元，可以明顯減輕患者的癥狀。本領域公知，由于神經元是終末分化細胞，不能通過細胞分裂增殖的方法獲得，因此，移植細胞來源于其他個體，如因外傷或疾病死亡的捐獻者或胎兒。這類細胞很難獲得，即使能夠得到，由于來自其他個體，會引發免疫排斥反應，最終仍將導致移植細胞凋亡或死亡，治療失敗。因此，能從患者自體來源的細胞誘導出能產生多巴胺的神經細胞的方法顯得非常重要。

如何從自體來源的細胞誘導出能產生多巴胺的神經細胞？有關研究通常嘗試以下方法：一是從來源于自體的神經干細胞誘導產生，由于從自體獲得神經干細胞也是非常困難的，因此，實際應用價值不大；二是從自體來源的成纖維細胞誘導產生多能干細胞，再誘導多能干細胞向多巴胺神經元分化。然而，目前的方法還不能完全誘導多能干細胞定向分化，值得注意的是，未完全分化的干細胞有產生畸胎瘤的危險！實際應用也存在限制。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷與不足，提供一種誘導產生多巴胺樣神經元的方法，尤其涉及直接將人成纖維細胞轉變成能產生神經遞質多巴胺的神經元樣細胞的方法。

本發明的另一目的是提供所述方法獲得的神經元樣細胞在制備減輕帕金森氏病大鼠的運動障礙制劑中的用途。

本發明的方法，可以繞過現有技術中所涉及的多能干細胞的環節，直接從來源于自體的成纖維細胞誘導能產生多巴胺的神經細胞，該直接誘導得到的神經細胞用于帕金森氏病大鼠動物模型，可以明顯減輕帕金森氏病大鼠的運動障礙。

具體而言，本發明的直接從人成纖維細胞誘導產生多巴胺樣神經元的方法，其特征在于，其包括：

1)選擇誘導人成纖維細胞轉變成能產生多巴胺的神經細胞的轉錄因子及其組合，

本發明中，可以參與直接將人的成纖維細胞轉變成能產生多巴胺的神經細胞的8個轉錄因子，它們是：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B和EN1，本發明中，優選Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的組合，更優選Mash1，Ngn2或Sox2轉錄因子或及其與其他因子的組合。

表1是八種參與誘導人成纖維細胞轉變成多巴胺神經細胞的轉錄因子。

表1

2)構建相關的載體及介導轉錄因子轉移，

構建攜帶Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B或EN1編碼基因的慢病毒載體；構建攜帶Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3編碼基因的腺病毒載體后，介導轉錄因子轉移。所述的相關病毒載體構建示意圖如圖1所示；

3)病毒載體感染人成纖維細胞及多巴胺樣神經細胞的鑒定，

首先使用上述攜帶8個轉錄因子的慢病毒感染人成纖維細胞，然后將感染過的人成纖維細胞接種到由失活的小鼠成纖維細胞組成的飼養層細胞上(經過10GyX-射線照射)，10-20天后可見存活的人成纖維細胞變長，并發出突起，實驗方法和步驟如圖2所示；

免疫熒光染色結果顯示，上述細胞開始表達神經元標志物Tuj1以及與多巴胺產生有關的酶，包括，酪氨酸羥化酶(tyrosine?hydroxylase，TH)，多巴脫羧酶(dopa?decarboxylase，DDC)，多巴胺轉運體(dopamine?transporter，DAT)。但是，五羥色胺(serotonin)及乙酰膽堿(CHAT)，染色陰性。

表2是多巴胺神經元的鑒定指標。

表2

本發明中，采用RT-PCR方法證實了在轉化后與多巴胺合成轉運相關基因的表達可以增加500-1100倍；

本發明中，還采用所述的Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的五個因子組合，在沒有飼養層細胞的情況下仍然能夠使人成纖維細胞轉變成產生多巴胺的神經細胞，如圖3所示。