[發明專利]水稻細胞轉化方法

有效

• 申請號: 201110303588.4
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN102337294A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 翟晨光;段永波;李浩;章旺根
• 申請（專利權）人: 先正達生物科技（中國）有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝;羅天樂

技術領域

本發明涉及植物遺傳學和基因工程領域。更具體地說，本發明涉及利用農桿菌介導和PMI選擇標記來制備轉基因水稻的方法。

背景技術

水稻(Oryza?sativa)是全世界一半以上的人口，尤其是亞洲國家人口的主糧。隨著人口膨脹和耕地減少，水稻產量越來越難以滿足需要。到2050年，世界人口將從現在67億人增加到92億人(聯合國，2007)，這就要求到2050年糧食供應還需增加50％。隨著半矮稈品種和雜交稻的推廣，轉基因手段被認為可望成為水稻增產的另一個突破點。2002年水稻全基因組測序完成后，可讀框的功能注釋和具有農學意義的基因的應用成為了水稻科研人員的主要研究目標。實現這一目的的前提條件是必須開發出高效率的水稻轉化系統。這樣的系統必須具有“多、快、好(可重復性高、基于成熟胚)、省”的特征，即能夠以更低的成本在更短的時間內產生出更多的可育植株。

隨著第一批轉基因水稻問世以來(Zhang?and?Wu?1988；Toriyama?et?al.1988；Zhang?et?al.1988)，已經通過不同的轉化方法，包括花粉管途徑(Luo?and?Wu?1988)、微粒轟擊(Christou?et?al.1991)、離子束(Yang?et?al.1994)等進行了大量的水稻轉化研究。目前最常用的轉化方法是農桿菌介導法。該方法由Hiei等人(Hiei?et?al.1994)建立。在此基礎上，已經在粳稻(Chen?et?al.1998；Enriquez-Obregon?et?al.1999；Toki?et?al.2006)、秈稻(Lin?and?Zhang?2005；Hiei?and?Kumar?2006)和爪哇稻(Dong?et?al.1996；Diah?and?Anzai?2006)中建立了分別使用來源于成熟胚的愈傷組織或未成熟胚作為外植體的水稻轉化系統。但這些轉化系統中都需要用到抗生素或除草劑等有毒物質進行選擇，對環境有潛在的影響。作為替代，已經有人開發了以磷酸甘露糖異構酶(pmi)基因作為選擇標記，用無毒物質甘露糖作為正選擇劑的轉化系統(Joersbo?and?Okkels1996)。

PMI是首先由Miles和Guest從大腸桿菌中分離出來并測序(Miles?and?Guest，1984)。植物利用PMI能夠將大部分植物無法代謝的6-磷酸甘露糖形式的甘露糖轉化為大多數植物能夠代謝的6-磷酸果糖。這樣表達pmi基因的植物能夠以甘露糖為唯一碳源生長。在農桿菌介導的植物細胞轉化中使用pmi標記基因時，用甘露糖進行正選擇。與殺死未轉化細胞的負選擇不同，在正選擇中未轉化的細胞保持休眠，而經過轉化的表達pmi基因的細胞可以利用甘露糖作為碳源正常生長。這樣，在培養過程中不會發生未轉化細胞的壞死。由此，再加上碳元素是細胞骨架的重要成分，使得pmi基因在轉化中的效率較高。此外，甘露糖在自然界中常見，能夠被豆科植物如大豆(Lee?and?Metheson，1984)所代謝，因此對植物組織沒有不良作用。考慮到這些原因，人們已經在不同科的植物中嘗試了使用pmi作為選擇標記，例如禾本科的玉米(Negrotto?et?al.2000)、珍珠稷(O’Kennedy?et?al.2004)、翦股穎(Fu?et?al.2005)、高粱(Gurel?et?al.，2009)、小麥(Wright?et?al.2001)、和甘蔗(Jain?et?al.2005)；十字花科的擬南芥(Todd?and?Tague，2001)和卷心菜(Ku?et?al.2006)、薔薇科的蘋果(Degenhardt?et?al.2006)、番木瓜(Zhu?et?al.2005)和杏(Ramesh?et?al.2006)；大戟科的木薯(Zhang?et?al.2000)、茄科的西紅柿(Sigareva?et?al.2004)；藜科的甜菜(Joersbo?et?al.1998)；百合科的洋蔥(Aswath?et?al.2006)；和葫蘆科的黃瓜(He?et?al.2006)。由此可見pmi作為選擇標記基因在糧食作物新品種的選育中有很大的發展潛力。2009年歐盟已經批準了使用PMI選擇系統生產的轉基因玉米的進口和加工作為食品和飼料的用途。在水稻轉化研究中也已有人使用過pmi選擇系統(Lucca?et?al.2001；He?et?al.2004；Ding?et?al.2006)，但其報道的轉化效率都很低(僅6％左右)，不適于工業規模的生產。因此，本領域對于以PMI作為選擇標記的高效、簡便的水稻轉化方法存在需求。

發明內容