[發明專利]水稻細胞轉化方法

有效

• 申請號: 201110303588.4
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN102337294A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 翟晨光;段永波;李浩;章旺根
• 申請（專利權）人: 先正達生物科技（中國）有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝;羅天樂

1.一種將外源基因導入水稻日本晴品種的細胞的方法，包括下述步驟：

(1)將成熟水稻谷粒去殼、滅菌后將胚分離出來；

(2)取步驟(1)所得的分離的胚置于愈傷組織誘導培養基上在30℃暗培養2周以產生次生愈傷組織；

(3)將步驟(2)中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因和磷酸甘露糖異構酶(PMI)標記基因的農桿菌接觸20分鐘；

(4)將步驟(3)的愈傷組織轉移到共培養基上，23℃培養48小時；

(5)將步驟(4)的愈傷組織置于恢復培養基上培養5天；

(6)將步驟(5)的愈傷組織轉移到含有蔗糖和甘露糖的選擇培養基上，在30℃暗培養3周以獲得出芽的愈傷組織；和

(7)將出芽的愈傷組織轉移到再生培養基中繼續培養。

2.權利要求1的方法，進一步包括步驟：

(8)在再生培養基中培養3周的愈傷組織轉移至生根培養基中繼續培養。

3.權利要求1或2的方法，其中步驟3所述的與農桿菌接觸是將所述愈傷組織浸泡在所述農桿菌的懸液中，所述農桿菌的懸液是在侵染當天將農桿菌以OD₆₆₀約0.05-0.25懸浮包含如說明書表1所示成分的液體濾紙培養基中而制備的。

4.權利要求3的方法，其中所述農桿菌是根瘤農桿菌EHA105菌株。

5.權利要求1或2的方法，其中所述選擇培養基中含有5g/L的蔗糖和12.5g/L的甘露糖。

6.權利要求5的方法，其中所述選擇培養基中不含抗生素或除草劑。

7.權利要求1或2的方法，其中所述PMI標記基因的核苷酸序列選自：

(1)SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)編碼SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

8.一種生產轉基因水稻日本晴品種的方法，包括：

1)通過1-7中任一權利要求的方法將外源基因導入水稻日本晴品種的細胞；和

2)從步驟1)獲得的細胞培育水稻日本晴品種的植株。