[發明專利]一種肝素的檢測方法

有效

• 申請號: 201110302864.5
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102445483A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 秦偉;陳燕
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: G01N27/333
• 分類號: G01N27/333
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及肝素檢測，具體地說是一種快速、準確、靈敏的檢測肝素的方法。

背景技術

目前，肝素檢測的分析方法主要有全血激活凝血時間法、分子光度法、熒光法以及高效液相色譜法。然而，全血激活凝血時間法需采用全血進行測定，而且血小板的存在會對實驗結果產生影響；分子光譜法難以實現在線、原位、實時、多組分同時測定，且該法檢測靈敏度較低；熒光法存在監測速度慢、連續性差、分析成本高、存在二次污染和無法在線監測等缺陷；高效液相色譜法對研究人員的技術要求較高，另外血液中的復雜成分會影響測定結果的準確性。

發明內容

本發明的目的在于針對上述不足之處提供一種快速、準確、靈敏的檢測肝素的方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案為：

一種肝素的檢測方法：利用離子選擇性電極黏附的聚合物敏感膜相中魚精蛋白與水相中肝素的特異性結合，通過電位測定儀測定加入不同濃度肝素后的電位變化，根據電位變化速率測定待測樣品中肝素的濃度。

利用離子選擇性電極黏附的聚合物敏感膜中魚精蛋白與待測溶液中的肝素形成絡合物進入水相，同時膜相中氯離子也隨著魚精蛋白進入水相，引起電位的變化，根據電位的初始變化速率即得到待測樣品中肝素的濃度。所述聚合物敏感膜中加入親脂性的惰性鹽以增加聚合物膜的導電性。

所述離子選擇性電極頭上黏附的聚合物敏感膜是由聚合物基體材料、增塑劑、離子載體和親脂性的惰性鹽組成，按重量份數比為20-40∶40-80∶0.1-10∶0.1-10混合，混合后融入到四氫呋喃溶液中，攪拌使之成為均勻溶液，然后室溫下放置12-24h，即得到有彈性的聚合物敏感膜，所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰-硝基苯辛醚(o-NPOE)、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子載體為魚精蛋白；親脂性的惰性鹽為四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸銨(ETH?500)。

檢測過程具體為：

a.將未經活化的離子選擇性電極直接插入盛有緩沖溶液的測量池中，待電極穩定后得到基線電位；

b.將標準肝素加入測量池中，肝素與電極膜表面的魚精蛋白作用，電位下降，所述離子選擇性電極內插有內參比電極，同時Tris-HCl緩沖溶液和0.12M?NaCl作為內充液注入離子選擇性電極內，電極底部黏附聚合物敏感膜；

c.根據加入肝素后初始電位變化速率對肝素濃度繪制標準曲線；

d.將未經活化的離子選擇性電極直接插入盛有待測樣品的測量池中，產生樣品信號，通過樣品溶液的初始電位變化速率與標準工作曲線對照得到待測肝素的濃度。

作用原理：在緩沖溶液中，電極膜相中的魚精蛋白和氯離子能夠穩定存在，得到穩定電位，當加入肝素后，由于肝素和魚精蛋白之間強烈的相互作用，膜相中的魚精蛋白和肝素形成絡合物進入水相，同時氯離子也隨著魚精蛋白進入水相，從而引起電位的變化。

本發明的優點在于：

1.本發明電極膜中直接嵌入魚精蛋白，無需手工加入底物，因此該法操作簡便，誤差較小。

2.本發明采用魚精蛋白作為一種識別元件制備聚合物膜離子選擇性電極，由于魚精蛋白和肝素的結合常數比較大，對肝素的選擇性較好，血樣中親脂性較強的硫氰根和水楊酸根離子產生的干擾較小，因而本法可以直接用于血樣中肝素。

3.本發明電極制備簡單，無需活化，大大縮短了電極的制作周期。此外，本發明采用電位變化的初始斜率和待測物濃度關系進行定量，因而大大縮短了檢測時間。

附圖說明

圖1為本發明電極的示意圖(其中1為內參比電極，2為內充液，3為聚合物敏感膜，4離子選擇性電極)。

圖2為本發明電極的示意圖(其中1為內參比電極，2為內充液，3為聚合物敏感膜，4離子選擇性電極，5為外參比電極)。

圖3A為本發明電極和傳統的聚合物膜肝素選擇性電極對10^-3M硫氰根和10^-3M水楊酸根離子響應對照圖。

圖3B為本發明電極在10^-4M硫氰根和10^-4M水楊酸根離子存在下對0.4U/mL肝素的響應圖。

圖4為本發明電極測定不同濃度肝素標準信號響應曲線。

圖5為本發明電極測定不同濃度肝素的標準工作曲線。

圖6為本發明電極測定不同濃度胰島素的標準信號響應曲線。

圖7為本發明電極不同濃度胰島素的標準工作曲線。