[發明專利]一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法

有效

• 申請號: 201110296601.8
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN103033401A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 丁蘭平;黃冰心
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭

技術領域

本發明涉及一種生物體顯微和超微結構研究中的制片方法，尤其是一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法。

背景技術

顯微和超微結構研究是揭示生命現象和過程的必需手段，從荷蘭科學家虎克發明顯微鏡以來已經有300多年，取得了許多進步，但該領域的研究往往受到樣品處理過程中制片技術的好壞所影響。

大型海藻，是海洋中的大型低等植物，其長度從幾毫米至幾十米，常見的一般大多屬于厘米級，粗度一般也就幾毫米長，常見的大型海藻體積都比較小。那么，開展其顯微和超微結構研究已成了對其進行精確鑒定、分類和生命活動等研究必不可少的一個環節。然而，針對多數如此小的生物，進行其顯微和超微結構研究在制片上存在很大難度，特別是針對其表皮細胞的難度更大，因此目前現有的制片方法大多都是直接來源于高等植物。過去該領域的學者主要從兩個方面進行染色觀察：1.制作切片后染色觀察；2.樣品表面直接觀察。這些方法存在明顯的不足：1.切片只能觀察到部分組織和結構，不能顯現觀察對象的全貌；2.通過表面直接觀察，由于其內部有其它組織細胞，導致觀察結果往往受到干擾；3.無論是切片還是表面觀察，其超微觀察結果通常不好，無法獲得所需組織結構的清晳照片等圖像信息。

我們在開展大型海藻的研究過程中，經常碰到此類問題，也曾尋找文獻，都未能解決這個問題。如何有效地分離大型海藻的表皮層，成為了學科發展的一個難題。迄今為止，尚未見到任何有關利用試劑特性來解離大型海藻表皮制片的報道。

發明內容

針對現有技術中存在的不足，本發明提供一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法。

一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，包括如下步驟：

（1）配制苯胺藍染色混合試劑：母液配制比例為：乳酸︰苯酚︰甘油︰水=1︰1︰1︰1，然后以母液為基礎配制0.5%(w/v)苯胺藍染色混合試劑；

（2）選取樣品：選擇目標樣品并進行清潔，去除藻體表面的雜質和雜藻，切成長約1—1.5cm的樣品段；

（3）染色及表皮細胞層解離：取多數樣品，加入步驟（1）制得的混合試劑，一般4—8根樣品加入混合試劑1滴，正常處理樣品的處理時間為10—12分鐘，幼嫩組織的處理時間為3—4分鐘，讓樣品表皮細胞層與內皮層細胞間充分解離并染色；

（4）染色表皮片層的分離：切開表皮層，移去內部組織，可制成面積可達1?cm²的染色表皮細胞片層；

（5）染色表皮片層制片：染色表皮片層移置預先準備的載玻片，加保濕防腐劑，封片。

在步驟（1）中，先將苯酚、乳酸、甘油和水的混合過程中進行加熱。

在步驟（2）中，在超聲波清洗儀中處理樣品8-10分鐘，幼嫩組織處理3-4分鐘，用潔凈海水沖洗樣品，鏡檢清洗效果。

在步驟（3）中，挑選藻體表面干凈、均勻的樣品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺藍溶液，翻動樣品，使之均勻著色；針對樣品表皮細胞與內皮層細胞質地和致密性差異，利用苯酚的腐蝕性特點，解離表皮與內皮層細胞間的粘質和胞間連結。

在步驟（4）中，左手用尖鑷子輕壓樣品內部組織部分，右手用解剖針輕輕從左至右劃開表皮細胞層，用軟毛筆移去內部組織，可制成面積可達1?cm²的染色表皮細胞片層。

本發明的優點和積極效果如下：

1）能精確分離出表皮細胞層。

2）所制備的表皮片層面積大，適合多種用途。

3）制片速度快，花費極少，經濟適用。

4）表皮細胞不變形。

5）染色效果好，不易退色。

6）具有殺菌防腐作用，能較長時間保存。

本發明是一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制備方法，通過此種方法制備的大型海藻表皮片層不但具有明顯的結構特征—超微結構清皙，細胞不變形，而且可展現連續的形態結構差異，在形態學、解剖學、發育學及進化研究方面具有重要的應用價值。

具體實施方式

下面對本發明作進一步詳述，但不構成對本發明保護范圍的限制。本發明一方面是通過混合試劑中苯胺藍對樣品進行染色，另一方面根據大型海藻表皮層和內皮層質地和致密性存在差異的特性，利用苯酚的腐蝕性解離胞間粘質及其連結，達到表皮層和內皮層分離的目的。

實施例1：大型海藻成熟表皮片層的制備