[發明專利]一種水環境微生物鑒定方法

無效

• 申請號: 201110295515.5
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102304586A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 靖德兵;王東;趙慧峰;單保慶
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及水處理領域，具體地說是一種廣適性的水環境微生物鑒定方法。

背景技術

變性梯度凝膠電泳技術(denaturing?gradient?gel?electrophoresis，DGGE)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術。1993年，Muzyer等首次將DGGE技術應用于微生物生態學研究，證實了這種技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優越性。現在，DGGE被認為是研究微生物遺傳多樣性和種群動態最有力的分子生物學技術(姜昕等，2007)。

DGGE不是基于核酸分子量的不同將DNA序列分開，而是根據序列的不同、將片段大小相同的DNA序列分開。雙鏈DNA分子中，A、T堿基之間有2個氫鍵，而G、C堿基之間有3個氫鍵連接，因此A、T堿基對對變性劑的耐受性要低于G、C堿基對。由于這4種堿基的組成和排列差異，使不同序列雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。當雙鏈DNA片段在含有梯度變性劑(尿素、甲酞胺)的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，解鏈的速度、程度與其序列密切相關，當某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置、并達到解鏈溫度時，即開始部分解鏈，部分解鏈的DNA片段的遷移速度隨解鏈程度的增大而減小，從而使不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，經過染色后凝膠形成為指紋帶譜。理論上，只要選擇的電泳條件(變性劑梯度、電泳時間、電壓等)足夠精細，僅有單一堿基差異的DNA片段也可被分開。

DGGE作為一種分子生物學技術，也具有多數分子技術所固有的缺點。除了如在PCR過程中產生的偏差等之外，其本身還有一些很難克服的缺點。Vallaeys等(1997)發現，有些細菌具有多操縱子，DGGE能將其在PCR時形成的不同序列分離開，這樣就可能導致過高的估計環境中的微生物多樣性；DGGE只能檢測到環境中優勢菌群的存在。Muyer等(1993)的研究也表明，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到。

發明內容

為了進一步提高PCR-DGGE工藝對水環境微生物的鑒定效果，本發明的技術方案為：采用新的核心設備-DGGE電泳槽，優化了PCR-DGGE技術流程，從而實現對水環境中種類繁多、好/厭氧類型混雜的微生物類群進行精確鑒定。

1、一種水環境微生物鑒定方法，包括如下步驟：

(1)提取底泥中的微生物DNA，

(2)用采用通用引物對GC-F338和R518，PCR擴增目的片段，

所述引物GC-F338：5′-CGC?CCG?CCG?CGC?GCG?GCG?GGC?GGG?GCG?GGG?GCA?CGG?GGG?GTAC?GGG?AGG?CAG?CAG-3′，

R518：5’-ATT?ACC?GCG?GCT?GCT?GG-3’；

(3)DGGE電泳分離PCR產物，

(4)DGGE條帶的切膠回收后重新PCR，所述引物為F338和R518，

所述引物F338：5’-TAC?GGGAGG?CAG?CAG-3′，

R518：5’-ATT?ACC?GCG?GCT?GCT?GG-3’；

(5)回收二次PCR產物，與表達載體連接，轉化，培養，提取質粒，PCR檢測，

(6)陽性質粒測序，確定所含微生物的種類。

所述表達載體為Pmd18-T載體。

所述轉化所用生物體為DH5α感受態細胞。

所述PCR檢測中所述引物為M13-47和RV-M，

所述引物M13-47：5′-CGC?CAG?GGT?TTT?CCC?AGT?CAC?GAC-3′，

RV-M：5′-GAG?CGGATAACAATT?TCA?CAC?ACA?AGG-3′。

由于污泥成分的復雜性，和微生物種類的多樣性，常規的PCT-DGGE對污泥樣本的檢測雜亂，無法判斷優勢類群，本發明對常規的PCR-DGGE的工藝方法進行了優化，在第一次得到PCR產物是不是直接用于測序，而是將產物克隆，再次進行PCR檢測，得到的陽性質粒再用于測序，可清楚地鑒定出種類繁多的水環境微生物優勢類群。如實施例所述，對于某水域中某個點的測定，其表層優勢微生物種類為10種，而其亞表層為16類。

本發明優化后PCR-DGGE方法適用范圍廣，在不同水體類型、不同污染程度的水環境中均可以發揮預期的功能。

附圖說明