[發明專利]低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株及其應用

無效

• 申請號: 201110293244.X
• 申請日: 2011-09-29
• 公開（公告）號: CN102329743A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 吳雪昌;王品美;鄭道瓊;陶香林;劉天喆
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/06;C12N15/81;C12N15/01;C12R1/865;C12R1/465
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株——釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)FG1及其應用；以及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構建工業釀酒酵母工程菌的方法。

(二)背景技術

酒精濃醪發酵，簡單來說就是發酵過程中的高濃度發酵，具體表現在生產有以下特點：1、高酒份；2、高滲透壓；3、高酵母數。就酒精生產而言，不同原料、不同時期濃醪發酵的界限存在著明顯的差別；大概區分如下：淀粉質原料：酒精濃度在14～16％(V/V)，糖蜜原料：酒精濃度在10～12％(V/V)。

實現酒精濃醪發酵技術，可極大地提高設備利用率、減少工藝用水、降低蒸煮蒸餾能耗和生產成本，對提高乙醇生產的效率與經濟和社會效益具有重要現實意義和應用價值。與常規酒精發酵相比，釀酒酵母在濃醪發酵過程中，不僅面臨著更加嚴峻的環境脅迫(高滲、高酒精脅迫等)，還會因甘油、乙酸等副產物生成的增多而降低葡萄糖乙醇轉化率。因此，為達到工業化生產對發酵速率、乙醇產量和糖醇轉化率等技術指標的要求，選育副產物合成低并具有高耐性的工業釀酒酵母菌株是突破濃醪發酵技術瓶頸的關鍵所在。

甘油是釀酒酵母發酵生產乙醇過程中主要的副產物，約消耗4％～10％的總碳源，如這些碳源用于生成乙醇，全球每年無需增加成本即可增產乙醇13億升。目前，對酵母細胞甘油代謝途徑已研究比較透徹，應用基因代謝工程技術對甘油合成相關的基因及途徑進行修飾和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在發酵過程中對高糖、高濃度乙醇等脅迫因子耐受性下降，生長緩慢，進而引起發酵速率降低、發酵周期延長及乙醇產量降低等不良現象。針對一個或少量基因調控、機制已知的性狀，基因代謝工程方法是較容易和直接的可行性理性策略，但對于涉及多個基因及其調控網絡的復雜性狀(如發酵速率、耐受性等發酵性狀)，基因代謝工程技術很難達到預期效果，甚至會引起菌株關鍵性能的退化衰變。目前，已有研究應用基于全基因組水平的盲目育種技術——全基因組重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高濃度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生產性能如糖醇轉化率提高并不顯著，而且隨著醪液可發酵性碳源的增加，副產物合成也增加，極大限制了乙醇產量的提高。

綜上所述，應用單一的育種手段雖然能夠改良菌株某一方面的性狀，但很難獲得性能全面的優良菌株，而且容易導致生產菌株關鍵性能的退化衰變。要從根本上突破濃醪發酵技術瓶頸，獲得性能全面的優良釀酒酵母菌株，還是需要結合不同的工業微生物育種策略優勢，實現優劣互補，集成創新，更有效、快速地進行工業生產菌株的改良。

(三)發明內容

本發明的目的是提供一株具有低副產物合成和高酒精耐性的工業釀酒酵母工程菌株及其應用，以及一種集成基因代謝工程與全基因組重排技術改良菌株多種生產性能的方法。

本發明采用的技術方案是：

一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株——釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)FG1，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號：CCTCC?No：M?2011274，保藏日期：2011年8月1日。

本發明還涉及所述釀酒酵母CCTCC?No：M?2011274在微生物工業濃醪發酵生產酒精中的應用。

具體的，所述應用為：將釀酒酵母CCTCC?No：M?2011274接種至以雙酶法配制的玉米糖化醪發酵液，30～35℃發酵60～80h，發酵結束后發酵液經分離純化獲得酒精。

具體的，所述玉米糖化醪發酵液可按常規雙酶法配制，本發明中具體如下：取玉米粉，加2～3倍質量的水調漿，攪拌加熱至50～70℃，加入耐高溫α-淀粉酶10U～30U/g玉米粉，混勻后加熱至80～90℃進行糊化液化，100～110℃保溫0.5～2h；糊化醪冷卻至50～70℃，加入糖化酶100U～300U/g玉米粉，55～60℃糖化0.5～1.0h，即得所述玉米糖化醪發酵液。

本發明還涉及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構建工業釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括：

(1)誘導釀酒酵母菌株產孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Y1和交配型α的單倍體菌株Y2作為出發菌株；