[發明專利]一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp及突變方法

無效

• 申請號: 201110293170.X
• 申請日: 2011-10-07
• 公開（公告）號: CN102382844A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 李國才;解如山;汪靜;杜慶輝;焦紅梅;嚴華;潘興元;陳紅菊;龔衛娟;錢莉;季明春
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及醫學微生物學領域，具體涉及一種淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突變方法。

背景技術

淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）的天然宿主是人類，感染后導致性傳播疾病淋病，可引起一系列病變，包括局部感染（如尿道炎、副睪炎、宮頸炎，輸卵管炎等）和全身播散性感染。輸卵管、盆腔等部位的病變可導致不孕癥或宮外孕等嚴重后遺癥。淋病患者還大大增加了艾滋病的發病機會。淋病發病率高，全球每年新發病例約6200萬。越來越嚴重的淋病奈瑟菌耐藥性現象給淋病治療帶來了越來越大的困難。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重點方向之一。

淋病奈瑟菌疫苗研制歷經艱難，二十世紀七十年代全細胞疫苗的人體試驗遭遇失敗，研究的重點開始轉向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個被純化的淋病奈瑟菌亞單位成分，盡管純化后的菌毛能夠刺激機體產生較高滴度的抗體，但是由于菌毛表面一些表位變異程度高，這些抗體并不具有顯著的免疫保護作用。同樣由于高度變異的原因，另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持續表達在淋病奈瑟菌表面的Ⅰ型外膜蛋白，具有免疫原性強、抗原相對保守等特點。90年代初期曾用覆蓋多數血清型的porin疫苗進行動物免疫實驗，效果并不十分理想。分析其原因，發現從淋病奈瑟菌細胞中提取的porin疫苗中污染了大量Rmp蛋白，后者是很好的免疫原，其免疫原性比porin高，能刺激機體產生補體結合抗體，但這些抗體不但沒有抗菌作用，相反能對porin抗體的抗菌活性產生拮抗作用，甚至能增強淋病奈瑟菌的感染性。隨著基因工程技術的迅速發展，用基因工程技術表達淋病奈瑟菌抗原成為研制淋病疫苗的重要方向。人們已經成功表達了多種淋病奈瑟菌抗原，如Porin、NspA、TbpA、TbpB、LOS等，用蛋白質相關技術進行純化和復性，配合一定佐劑免疫小鼠，發現在小鼠體內均可以誘導產生特異性保護抗體。

從目前的淋病奈瑟菌疫苗的研究現狀分析，用單一一種抗原的淋病奈瑟菌疫苗完全預防淋病奈瑟菌感染是非常困難的。盡管這種疫苗可以產生一定的保護力，但是，如果這種接種只是使淋病奈瑟菌感染轉為無癥狀型，感染者因而不就醫，那反而會增加淋病奈瑟菌的傳播。因此，含有更多甚至全部淋病奈瑟菌保護性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候選。

發明內容

野生型淋病奈瑟菌中含有免疫阻遏基因rmp，該基因的產物蛋白Rmp可誘導機體產生對抗保護性抗體的有害抗體。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種突變rmp，以及一種淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突變方法，從而避免有害抗體產生的有效方法，解決了研制淋病奈瑟菌全細胞疫苗的瓶頸問題。

本發明所述的突變免疫阻遏基因Δrmp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示。

本發明所述的突變免疫阻遏基因Δrmp通過以下方法獲得：是以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，PCR擴增rmp基因，并連接到T載體pMD19中，以連接產物pMD19rmp為模板，擴增包含rmp基因下游側翼區、pMD19載體骨架和rmp基因上游側翼區的線性DNA片段，與相同酶切處理的卡那霉素抗性基因Kanr連接，得到的突變基因Δrmp。

本發明所述突變方法，包括步驟如下：

（1）rmp基因的克隆：以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2的序列為引物通過PCR擴增出序列如SEQ?ID?NO.3所示的淋病奈瑟菌rmp基因；

（2）rmp上下游兩側側翼區的擴增：以上述（1）中擴增的rmp基因與pMD19-T載體的連接產物pMD19rmp為模板，擴增包含rmp基因兩側側翼區的線性片段；擴增包含rmp基因兩側側翼區線性片段的正反向引物序列分別如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示，擴增得到序列如SEQ?ID?NO.6所示的包含rmp基因兩側側翼區的線性片段；

（3）以質粒pET-28a(+)為模板，擴增Kanr基因序列

其中引物序列為SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8所示，經PCR擴增得到的?Kanr基因序列如SEQ?ID?NO.9所示；

（4）rmp基因的插入突變