[發(fā)明專利]一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp及突變方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110293170.X
• 申請(qǐng)日: 2011-10-07
• 公開（公告）號(hào): CN102382844A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李國(guó)才;解如山;汪靜;杜慶輝;焦紅梅;嚴(yán)華;潘興元;陳紅菊;龔衛(wèi)娟;錢莉;季明春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/10
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.?一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示。

2.一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp的突變方法，其特征在于，是以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增rmp基因，并連接到T載體pMD19中，以連接產(chǎn)物pMD19rmp為模板，擴(kuò)增包含rmp基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和rmp基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段，與相同酶切處理的卡那霉素抗性基因Kanr連接，得到的突變基因Δrmp。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變方法，其特征在于，步驟如下：

（1）rmp基因的克隆：以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2的序列為引物通過PCR擴(kuò)增出序列如SEQ?ID?NO.3所示的淋病奈瑟菌rmp基因；

（2）rmp上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴(kuò)增：以上述（1）中擴(kuò)增的rmp基因與pMD19-T載體的連接產(chǎn)物pMD19rmp為模板，擴(kuò)增包含rmp基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；擴(kuò)增包含rmp基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段的正反向引物序列分別如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示，擴(kuò)增得到序列如SEQ?ID?NO.6所示的包含rmp基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；

（3）以質(zhì)粒pET-28a(+)為模板，擴(kuò)增Kanr基因序列

其中引物序列為SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的?Kanr基因序列如SEQ?ID?NO.9所示；

（4）rmp基因的插入突變

將步驟（2）得到的攜帶rmp基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段用Mlu?I和Xho?I雙酶切處理；步驟（3）得到的Kanr基因擴(kuò)增產(chǎn)物用同樣的雙酶切消化；二者分別回收純化后用T4連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物pMD19Δrmp中載體骨架之外即為淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp，其序列如SEQ?ID?NO.10所示。