[發明專利]畢赤酵母表達重組人白介素11的生產方法

有效

• 申請號: 201110293041.0
• 申請日: 2004-11-25
• 公開（公告）號: CN102329388A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 黃巖山;馬國昌;楊志愉;李輝;孫漢棟;徐飛虎;周金寶
• 申請（專利權）人: 杭州九源基因工程有限公司
• 主分類號: C07K14/54
• 分類號: C07K14/54;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

本申請是2004年11月25日提交的、申請號為200410089088.5、發明名稱為“畢赤酵母表達重組人白介素11的生產方法”的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及應用重組DNA技術生產基因工程蛋白藥物技術，具體來說涉及一種從表達重組人白細胞介素11(rhIL-11)的畢赤酵母工程菌高密度發酵液中大規模純化rhIL-11的方法。

背景技術

人白細胞介素11(human?Interleukin?11，hIL-11)是與許多造血細胞相互作用的細胞因子，最早是從IL-1a刺激的哺乳動物骨髓細胞系PU-34的條件培養基中被鑒別的活性物質，可長期維持培養的血細胞的生存，隨后從人胚胎成纖維細胞系中克隆到hIL-11cDNA。天然的hIL-11成熟蛋白含178個氨基酸，分子量19Kd；不含半胱氨酸，因而缺少二硫鍵，但蛋白的結構卻相當穩定；沒有糖基化修飾；富含脯氨酸(12％)，亮氨酸(23％)及正電荷殘基(14％)，等電點為11.7。

hIL-11是由多種細胞產生并與多種細胞作用的細胞因子。rhIL-11可與其它因子協同作用刺激人的粒細胞，紅細胞及巨核細胞的前體細胞生長，最終導致血小板數量的增加。除了造血細胞，rhIL-11還作用于其它細胞，具有促進消化道上皮損傷的恢復、調節脂肪細胞分化等多種生物活性(Du?X?X，Williams?D?A.Review?of?molecular，cell?biology，and?clinic?use.Blood，1997，89(11)：3897-3908；Reynolds?CH.Clinical?efficacy?of?rhIL-11，Oncology(Huntingt)，2000，14(9Suppl?8)：32-40)。

1997年，美國Genetic?Institute公司(GI)生產的rhIL-11獲準上市，用于防止化療引起的再生性血小板減少癥(Kaye?JA?et?a1.FDA?licensure?of?NEUMEGA?to?prevent?severe?chemotherapy-induced?thrombocytopenia，Stem?Cells，1998，16(Suppl?2)：207-223；Rust?DM，Wood?LS，Battiato?LA?et?al.Oprelvekin：an?alternative?treatment?for?thrombocytopenia，Clin?J?Oncol?Nurs，1999，3(2)：57-62)。GI于1993年獲得hIL-11基因(專利號US5215895)，1997年補充了該專利(專利號US5700664)，1998年獲得生產方法發明專利(專利號US5760189)，這些專利都在美國申請。GI采用的是大腸桿菌融合表達生產方法。但這種系統存在以下缺點：(1)表達量不高，(2)生產成本過高，(3)蛋白純化工序復雜。畢赤酵母是近年來發展起來的一種外源蛋白表達系統(Cereghino?JL，Cregg?JM.Heterologous?protein?expression?in?the?methylotrophic?yeast?Pichia?pastoris.FEMS?Microbiol?Rev，2000，24(1)：45-66)。它既具有大腸桿菌系統操作簡單的優點，又對重組蛋白有一定的折疊和加工能力。本專利申請人曾提出了用甲醇酵母生產重組人白細胞介素11的方法(申請號：99118279.0)，可以極其方便的獲得大量具有生物學活性的rhIL-11。但是該方法需要將發酵液離心后通過超濾等方法進行濃縮，去除發酵液中的雜質，降低電導，然后通過離子交換層析，疏水層析及凝膠層析的順序組合來純化蛋白，工序比較復雜，經離子交換層析后，雜蛋白和內毒素含量仍然比較高，不利于后續純化。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種畢赤酵母表達重組人白介素11的生產方法，該方法采用了一般大規模蛋白純化很少使用的反相層析方法，用來代替常用的超濾濃縮和離子交換層析兩個步驟。采用本發明的方法，既可以減少純化工序，也可以提高純化效率和收率，更有利于雜蛋白和色素，內毒素等雜質的去除。