[發(fā)明專利]煙曲霉半乳甘露聚糖抗原的提取與純化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110289099.8
• 申請(qǐng)日: 2011-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN103030702A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史東東;何永勝;周澤奇;李寧;王東東;粟艷;彭潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津貽諾琦生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C08B37/00
• 分類號(hào): C08B37/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及診斷用抗體制備領(lǐng)域，特別是用于半乳甘露聚糖(Galactomannan)的抗體制備過程中免疫動(dòng)物所需抗原的提取及純化。?

背景技術(shù)

近年來，隨著抗生素的大量濫用和免疫抑制劑在臨床的廣泛使用，侵襲性深部真菌感染的發(fā)病率和病死率越來越高。其中，曲霉特別是煙曲霉(Aspergillus?fumigatus)已經(jīng)逐漸成為臨床上一種重要的致病真菌。目前侵襲性曲霉菌感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是無菌體液培養(yǎng)和組織活檢。然而侵襲性曲霉感染病情進(jìn)展很快，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法陽(yáng)性率低、周期長(zhǎng)，往往造成漏診、誤診，致使貽誤病情。因此，檢測(cè)煙曲霉抗原是目前臨床公認(rèn)的快速早期診斷煙曲霉菌感染的有效方法。煙曲霉分泌性抗原為半乳甘露聚糖抗原，在感染早期可從患者血液中發(fā)現(xiàn)。基于此，從煙曲霉菌中分離提取其半乳甘露聚糖抗原并制備單克隆抗體是實(shí)現(xiàn)煙曲霉感染早期免疫學(xué)診斷的重要策略。本發(fā)明建立了一種可用于免疫動(dòng)物實(shí)現(xiàn)抗體制備的半乳甘露聚糖抗原提取與純化方法。?

煙曲霉分泌到胞外的半乳甘露聚糖抗原為一種多糖，一般從該菌的培養(yǎng)液中提取得到。國(guó)內(nèi)對(duì)半乳甘露聚糖抗原提取純化的研究不多，目前從培養(yǎng)液中分離提純半乳甘露聚糖抗原主要為粗提物，文獻(xiàn)1中用4倍體積無水乙醇沉淀煙曲霉培養(yǎng)液上清，再用75％乙醇洗3遍，即得到煙曲霉分泌型抗原粗提物。文獻(xiàn)2中提到用3倍體積的乙醇沉淀培養(yǎng)液濾液4℃過夜，再于4℃下3000g離心10分鐘，即得到粗提物，然后于100℃下在1.5摩爾的亞硝酸中處理2小時(shí)。經(jīng)0.45um濾膜過濾后所得濾液即為半乳甘露聚糖抗原純品。文獻(xiàn)3用4倍體積的乙醇沉淀煙曲霉培養(yǎng)液濾液后，將沉淀用無水乙醇洗3遍，凍干，每15mg沉淀物加入1ml無水肼中，105℃過夜。之后用4倍體積無水乙醇沉淀、無水乙醇洗滌、自來水透析。再于1.5摩每升終濃度的亞硝酸溶液中室溫過夜處理，然后向溶液中鼓入空氣。經(jīng)透析后用4倍體積無水乙醇沉淀，再用無水乙醇洗滌、凍干。在重復(fù)上述無水肼和亞硝酸處理步驟一次。將經(jīng)上述處理得到的物質(zhì)用MonoQ層析柱純化，最終得到半乳甘露聚糖純品。?

鑒于煙曲霉分泌到培養(yǎng)液中的多糖組分主要為半乳甘露聚糖，其他種類的多糖分泌量很少，因此考慮到乙醇沉淀煙曲霉培養(yǎng)液濾液得到的粗提物再經(jīng)簡(jiǎn)單的方法適當(dāng)純化就能達(dá)到很高的純度。超濾技術(shù)是一種以篩分為分離原理、以壓力為推動(dòng)力的膜分離過程，利用超濾技術(shù)可有效去除溶液體系中特定分子量以下的高分子有機(jī)物。本研究即是基于超濾技術(shù)對(duì)煙曲霉抗原粗提物進(jìn)行純化，從而得到了純度90％以上的半乳甘露聚糖抗原。本方法原理簡(jiǎn)單，操作時(shí)間短，條件易掌控，便于批量生產(chǎn)，非常有利于作為抗體生產(chǎn)過程的免疫原制備。?

本發(fā)明詳細(xì)描述?

本發(fā)明的目的在于提供一種利用超濾技術(shù)來純化煙曲霉分泌型抗原的方法。?

本發(fā)明所采用的煙曲霉菌株購(gòu)買自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。?

本發(fā)明技術(shù)方案如下：?

步驟：?

1)煙曲霉液體培養(yǎng)采用通用的沙氏液體培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含1％蛋白胨，4％D-葡萄糖。培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速速度為200轉(zhuǎn)每分，培養(yǎng)時(shí)間大約46小時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)液pH值降至4.2-4.5時(shí)停止培養(yǎng)。?

2)上述培養(yǎng)液經(jīng)121℃濕熱滅菌40分鐘，殺死菌體及可能存在的芽孢。所得菌液室溫下經(jīng)定性濾紙過濾，濾液經(jīng)0.22μm濾膜過濾以除去菌體。?

3)所得濾液轉(zhuǎn)移至潔凈燒杯中，加入4倍體積無水乙醇。4℃靜置過夜。?

4)4℃，16,000g離心15分鐘，將沉淀溶于去離子水中。?

5)加4倍體積無水乙醇，靜置1小時(shí)。?

6)離心分離沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌三次。?

7)4℃，16,000g離心15分鐘，棄上清。?

8)將所得沉淀用去離子水溶解，再加入活性炭粉末，室溫?cái)嚢?小時(shí)。?

9)室溫抽濾，除去活性炭顆粒。?

10)所得濾液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。?

11)濾液轉(zhuǎn)移至10KD離心超濾管，5000g離心10分鐘。即得到半乳甘露聚糖純品。?

本發(fā)明中，因半乳甘露聚糖抗原粗提物為棕褐色物質(zhì)，色素含量很高。活性炭常用于制糖業(yè)的糖液脫色，所以本研究用活性炭對(duì)抗原溶液進(jìn)行脫色，得到的抗原溶液顏色均一澄清，稍有淺褐色。由于半乳甘露聚糖抗原為30KD左右的分子，所以用10KD超濾管做超濾處理，可有效除去100KD以下的蛋白質(zhì)、雜糖及糖蛋白。而半乳甘露聚糖會(huì)因分子體積大而被超濾膜截留住，從而實(shí)現(xiàn)半乳甘露聚糖的純化。?