[發明專利]一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法

無效

• 申請號: 201110289019.9
• 申請日: 2011-09-26
• 公開（公告）號: CN102329868A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 汪志平;董丹丹;邵斌;藍瑾瑾;王景梅;劉新穎;于金鑫;呂蓓芬;陳子元
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于螺旋藻開發應用的技術，特別涉及一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法。

背景技術

螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門(Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學研究，1997，15(4)：369-374]，因其富含優質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，目前已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產業，并應用于食品、生物醫藥保健、飼料、精細化工等領域。該屬中的鈍頂螺旋藻(Spirulina?platensis)是國內外在商業化養殖生產與開發中應用最廣泛的品種。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產實踐表明，鈍頂螺旋藻種下有許多品系，它們對溫度、光質、光照強度，以及培養液的鹽度、pH和營養成分等環境因子的要求與適應性存有顯著差異[水生生物學報，1999，23(1)：59-64]。目前國內外幾乎都采用開放或半封閉、跑道型循環式培養池這一較粗放的養殖生產模式，許多環境因子，特別是溫度和光照強度，難以人為調控，有些鈍頂螺旋藻品系在實驗室或生產小試中雖然表現出優良的生產性能，但進入生產池后，因難以適應環境因子的較大變化而無法應用于大規模生產。因此，選育品性兼優的品系一直是螺旋藻養殖生產與開發中最重要的環節與技術要點之一。

目前國內外鑒別螺旋藻品系優劣的常規方法是，先在實驗室作多種環境因子交叉組合培養試驗，根據所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初步篩選；再依次轉接到室外約5m²、50m²及500m²的培養池中于不同季節與氣候及營養條件下進行養殖小試、中試與生產性試驗，進而篩選出優良藻株。這一方法雖然實用，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足之處，建立既實用，又簡便、耗時少、低成本的螺旋藻品系優劣的鑒別新方法，以滿足當前國內外螺旋藻產業不斷發展的實際需要。

本發明是在長期研究螺旋藻分子遺傳學背景，特別是螺旋藻細胞骨架蛋白基因ftsZ的基礎上，建立起一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的新方法。

我們通過設計特定的引物，利用PCR等分子生物學方法克隆并測定了5株鈍頂螺旋藻品系(分別為Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37)的ftsZ基因序列，進而利用生物信息學及分子系統分類學等分析顯示，依據ftsZ基因序列的差異位點數和相似程度，這5株品系被分成有顯著差異的兩大類。即Sp-4、Sp-12和Sp-17為一類；Sp-18和Sp-37為另一類。長期的實驗研究與生產實踐表明，這5株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環境因子能自動調控的實驗室培養試驗中均表現優良，但只有Sp-4、Sp-12、Sp-17這三株品系在實際生產養殖中表現優良，Sp-18和Sp-37因適應能力差而不能用作生產良種。由此可見，ftsZ基因序列特征與螺旋藻生產性狀存在著相關性。因此，應用ftsZ基因序列可以作為鑒別螺旋藻生產性狀優劣的分子標記，即被鑒別品系的ftsZ基因序列若與Sp-4、Sp-12、Sp-17的聚成一類，則可能生產性狀優良；若與Sp-18、Sp-37的聚成一類，則可能不可應用于生產。

具體地，為解決技術問題，本發明提供的判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法，是對被鑒定螺旋藻品系的ftsZ基因進行測序，并與已知鈍頂螺旋藻品系Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37一起進行基于ftsZ基因序列的差異位點數分析及系統發生樹構建；如果被鑒別螺旋藻品系與Sp-4、Sp-12和Sp-17的ftsZ基因序列聚成一類，表示被鑒定螺旋藻品系生產性狀優良能夠應用于大規模養殖生產；如果被鑒別螺旋藻品系與Sp-18、Sp-37的ftsZ基因序列聚成一類，則表示被鑒定螺旋藻品系適應能力差不能應用于大規模養殖生產。

該方法具體包括以下步驟：

(1)PCR引物設計與擴增

利用Primer?5.0引物設計軟件進行PCR擴增引物的設計，得到上游引物PF：5’-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3’、下游引物PR：5’-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3’；