[發明專利]一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201110288372.5
• 申請日: 2011-09-26
• 公開（公告）號: CN102426229A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 孫力軍;王雅玲;劉陽;徐德峰;聶芳紅;劉喚明
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/569;G01N1/40
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

技術領域

本發明涉及一種免疫磁珠的制備方法及應用，具體涉及一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用，該制備方法用于分離致病性金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus），包括金黃色葡萄球菌免疫磁珠的制備方法和應用方法，屬于病原菌分離技術領域。

背景技術

免疫磁珠分離技術（Immunomagnetic?bead-based?separation,IMS）是近年來發展起來的一項新的免疫學技術。包裹有一定復合有機材料的微小磁珠在一定條件下既可結合蛋白質抗體成為抗體一磁珠二聯體，將其加入經過前處理的樣品中，磁珠上的特異性抗體可以和相應的抗原結合從而形成抗原一抗體一磁珠復合物（免疫磁珠，Immunomagnetic?bead,?IMB），這種復合物在磁力作用下，發生力學移動，使之與樣品中的其它物質分離，而達到分離特定抗原的目的。免疫磁珠（IMB）是一個平臺，凡是利用抗原抗體結合原理進行工作的領域都可以應用，并且已在醫學和生物學的骨髓移植、分離干細胞、細胞器、癌細胞、激素、病原菌等方面取得了顯著成績。近年來IMB?以其高度的敏感性和特異性被廣泛應用于食品、水、生物樣品、環境等標本中病原微生物的分離和檢測工作中，顯示出良好的開發應用前景。

在分離致病性微生物方面，IMB可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物。IMB對目的菌的富集具有高分離率、高特異性、高穩定性、無污染、無毒性、操作簡便的特點。使用該方法樣品用量少且不會傷及細菌，較之常規檢驗法相比，更高效、更敏感。該方法省去了常規方法中的預富集培養步驟，直接對致病菌進行分離，在2-6h內即可完成。此外，由于IMB特異性高，且能夠識別性質極為相近的菌株，可以有效的區分致病性與非致病性菌株，從而減少漏檢，顯著地提高了分離準確率，減少了假陽性的出現。

近年來，免疫磁珠技術對食源性致病菌分離的研究集中于沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特氏菌、副溶血弧菌等。根據常規免疫磁珠的制備原理，對于上述致病菌的免疫磁珠制備較繁瑣，首先要制備這些菌種的單克隆抗體或多克隆抗體，然后將抗體與磁珠偶聯，從而對菌株進行分離。因此，免疫磁珠的分離效果（準確度和靈敏度）直接受到抗體純度的影響。本發明提及的人IgG免疫磁珠制備的原理是金黃色葡萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質??-金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA），它具有與人IgG的Fc片段特異性結合的能力，每個SPA分子可以同時結合2個人IgG分子，將人IgG與磁珠偶聯制成免疫磁珠，便可以用于分離金黃色葡萄球菌。人IgG分子的制備及純化的技術現已成熟，市場上可以買到低價位，高純度的人IgG標準品，為高質量低成本的人IgG免疫磁珠制備提供了條件。

目前，利用?SPA分子與人IgG特異性結合的原理分離人IgG的方法已相對成熟，而利用人IgG免疫磁珠分離金黃色葡萄球菌的研究僅處于初步階段，對磁珠的制備和用于金葡菌的分離等條件的優化沒有進行詳細的研究，磁珠的穩定性和富集能力還不高。本發明利用此原理對用于金黃色葡萄球菌富集的人IgG免疫磁珠的制備工藝及富集應用條件進行了優化，大大提高了對金黃色葡萄球菌的富集能力和檢測靈敏度，同時憑借其免疫磁珠自身的快速方便、不需要大型檢測儀器、價格低廉的特點運用于食品、飼料、醫療環境和自然環境中金黃色葡萄球菌的分離與富集，可以進一步提高快速檢測金黃色葡萄球菌效率。

發明內容

本發明的目的是為了彌補現有金葡菌檢測技術存在的不足，提供一種用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用。磁珠經過適量活化劑（EDC-NHS組合）處理后與人IgG在合適的條件下進行偶聯，制成人IgG免疫磁珠，將人IgG免疫磁珠加入待測經過前處理的樣品中，在一定的條件下捕獲金黃色葡萄球菌。

?為實現上述發明目的，本發明采取的技術方案是：該用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法是以磁珠為載體，偶聯人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；

一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法，該方法以磁珠為載體，偶聯人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；

具體方法是：

（1）活化：取磁珠放入離心管中，加入活化緩沖液洗滌磁珠，反復三次，每次間隔3~5分鐘，除去活化緩沖液后加入活化劑EDC和NHS各200μL，混勻，將磁珠于22~25℃條件下震蕩孵育30～60分鐘，將磁珠進行活化；