[發(fā)明專利]一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110288372.5
• 申請(qǐng)日: 2011-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102426229A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫力軍;王雅玲;劉陽(yáng);徐德峰;聶芳紅;劉喚明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/531
• 分類號(hào): G01N33/531;G01N33/569;G01N1/40
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種免疫磁珠的制備方法及應(yīng)用，具體涉及一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應(yīng)用，該制備方法用于分離致病性金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus），包括金黃色葡萄球菌免疫磁珠的制備方法和應(yīng)用方法，屬于病原菌分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic?bead-based?separation,IMS）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。包裹有一定復(fù)合有機(jī)材料的微小磁珠在一定條件下既可結(jié)合蛋白質(zhì)抗體成為抗體一磁珠二聯(lián)體，將其加入經(jīng)過(guò)前處理的樣品中，磁珠上的特異性抗體可以和相應(yīng)的抗原結(jié)合從而形成抗原一抗體一磁珠復(fù)合物（免疫磁珠，Immunomagnetic?bead,?IMB），這種復(fù)合物在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使之與樣品中的其它物質(zhì)分離，而達(dá)到分離特定抗原的目的。免疫磁珠（IMB）是一個(gè)平臺(tái)，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進(jìn)行工作的領(lǐng)域都可以應(yīng)用，并且已在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的骨髓移植、分離干細(xì)胞、細(xì)胞器、癌細(xì)胞、激素、病原菌等方面取得了顯著成績(jī)。近年來(lái)IMB?以其高度的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于食品、水、生物樣品、環(huán)境等標(biāo)本中病原微生物的分離和檢測(cè)工作中，顯示出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

在分離致病性微生物方面，IMB可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物。IMB對(duì)目的菌的富集具有高分離率、高特異性、高穩(wěn)定性、無(wú)污染、無(wú)毒性、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。使用該方法樣品用量少且不會(huì)傷及細(xì)菌，較之常規(guī)檢驗(yàn)法相比，更高效、更敏感。該方法省去了常規(guī)方法中的預(yù)富集培養(yǎng)步驟，直接對(duì)致病菌進(jìn)行分離，在2-6h內(nèi)即可完成。此外，由于IMB特異性高，且能夠識(shí)別性質(zhì)極為相近的菌株，可以有效的區(qū)分致病性與非致病性菌株，從而減少漏檢，顯著地提高了分離準(zhǔn)確率，減少了假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

近年來(lái)，免疫磁珠技術(shù)對(duì)食源性致病菌分離的研究集中于沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特氏菌、副溶血弧菌等。根據(jù)常規(guī)免疫磁珠的制備原理，對(duì)于上述致病菌的免疫磁珠制備較繁瑣，首先要制備這些菌種的單克隆抗體或多克隆抗體，然后將抗體與磁珠偶聯(lián)，從而對(duì)菌株進(jìn)行分離。因此，免疫磁珠的分離效果（準(zhǔn)確度和靈敏度）直接受到抗體純度的影響。本發(fā)明提及的人IgG免疫磁珠制備的原理是金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面一種特有的蛋白質(zhì)??-金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA），它具有與人IgG的Fc片段特異性結(jié)合的能力，每個(gè)SPA分子可以同時(shí)結(jié)合2個(gè)人IgG分子，將人IgG與磁珠偶聯(lián)制成免疫磁珠，便可以用于分離金黃色葡萄球菌。人IgG分子的制備及純化的技術(shù)現(xiàn)已成熟，市場(chǎng)上可以買(mǎi)到低價(jià)位，高純度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品，為高質(zhì)量低成本的人IgG免疫磁珠制備提供了條件。

目前，利用?SPA分子與人IgG特異性結(jié)合的原理分離人IgG的方法已相對(duì)成熟，而利用人IgG免疫磁珠分離金黃色葡萄球菌的研究?jī)H處于初步階段，對(duì)磁珠的制備和用于金葡菌的分離等條件的優(yōu)化沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)的研究，磁珠的穩(wěn)定性和富集能力還不高。本發(fā)明利用此原理對(duì)用于金黃色葡萄球菌富集的人IgG免疫磁珠的制備工藝及富集應(yīng)用條件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了對(duì)金黃色葡萄球菌的富集能力和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)憑借其免疫磁珠自身的快速方便、不需要大型檢測(cè)儀器、價(jià)格低廉的特點(diǎn)運(yùn)用于食品、飼料、醫(yī)療環(huán)境和自然環(huán)境中金黃色葡萄球菌的分離與富集，可以進(jìn)一步提高快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有金葡菌檢測(cè)技術(shù)存在的不足，提供一種用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應(yīng)用。磁珠經(jīng)過(guò)適量活化劑（EDC-NHS組合）處理后與人IgG在合適的條件下進(jìn)行偶聯(lián)，制成人IgG免疫磁珠，將人IgG免疫磁珠加入待測(cè)經(jīng)過(guò)前處理的樣品中，在一定的條件下捕獲金黃色葡萄球菌。

?為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：該用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法是以磁珠為載體，偶聯(lián)人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；

一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法，該方法以磁珠為載體，偶聯(lián)人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；

具體方法是：

（1）活化：取磁珠放入離心管中，加入活化緩沖液洗滌磁珠，反復(fù)三次，每次間隔3~5分鐘，除去活化緩沖液后加入活化劑EDC和NHS各200μL，混勻，將磁珠于22~25℃條件下震蕩孵育30～60分鐘，將磁珠進(jìn)行活化；